基于转运体的何首乌致肝损伤作用机制探讨△

汪祺，杨建波a，王莹，李妍怡，2，文海若*，马双成*

1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；

2.北京中医药大学，北京 100029

何首乌是蓼科植物何首乌Polygonum multijiorumThunb.的干燥块根。近年来，随着何首乌及其制剂的广泛应用，其临床不良反应报道逐渐增多，其中以何首乌致肝损伤问题较为常见[1-2]。统计发现，何首乌致肝损伤的临床表现多以胆汁淤积及高胆红素为主[3-4]。由于胆红素和胆汁酸等的代谢转运均与肝脏上的摄取和外排转运体相关，因此推测这些转运体功能出现障碍可能是何首乌致肝毒性的机制。

研究表明，有机阴离子转运多肽（OATPs）可介导药物及内源性物质如胆红素和胆汁酸的跨膜转运，其中OATP1a1和OATP1b2在肝脏中高表达，位于肝细胞的基底侧，对胆红素和胆汁酸的摄取起着至关重要的作用[5]。而多药耐药相关蛋白2（MRP2）和MRP3 在体内主要负责对胆酸盐的排泄，同时介导胆红素及其葡萄糖醛酸结合物排入胆汁，两者高表达于肝脏、肠及肾脏组织[6]。研究表明，MRP2、MRP3 蛋白功能受到影响时，肝脏表现出不同程度的胆汁酸或胆红素淤积，继而产生毒性反应[7]。此外，外排转运体如P-糖蛋白（P-gp）和乳腺癌耐药蛋白（BCRP）也在胆红素及胆汁酸代谢循环中起着重要的作用。胆汁酸也可经Na+-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）摄取进入肝细胞，再由肝细胞胆管侧的胆盐外排泵（BSEP）外排至胆汁[8-10]。由此可见，上述转运体被抑制可导致胆红素、胆汁酸代谢异常，从而产生肝毒性[11-12]。

因此，本研究以何首乌醇提物（PME）和何首乌水提物（PMW）为研究对象，考察大鼠长期灌胃PMW 和PME 后的毒性表现，同时测定给药后胆汁酸、胆红素代谢相关转运体（OATP1a1、OATP1b2、MRP2、MRP3、BSEP、NTCP、BCRP、P-gp）的表达变化，从而初探何首乌致肝损伤的可能机制，为何首乌的临床安全用药提供依据。

1 材料

1.1 实验动物

无特定病原体（SPF）级Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠40 只，体质量（200±20）g，购于斯贝福（北京）实验动物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK-2011-0004。标准动物房中饲养，室温22～24 ℃，相对湿度55%～60%，光照12 h 明暗交替，以SPF 级标准饲料喂养。动物实验由中国医学科学院药物研究所伦理委员会审批，审批号为00003037。

1.2 仪器

Multiskan MK3 型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；HH.S4型恒温孵育器（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）；DKZ-450B 型电热恒温振荡水槽（上海森信实验仪器有限公司）；TU-1901 型紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；TGL20M 型高速冷冻离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；VORTEX GENIVS 3 型漩涡混匀仪（美国Scientific Industries 公司）；iQ5 型聚合酶链式反应（PCR）仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 试药

何首乌药材（北京本草方源药业有限公司，批号：20160414）；异硫氰酸1-萘酯（ANIT，玛雅试剂有限公司，批号：MAYA-CR-5311）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒（批号：20170413）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（批号：20170417）、总胆汁酸（TBA）试剂盒（批号：20161025）、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（批号：20170414）、总胆红素（TBIL）试剂盒（批号：20170421）均购于南京建成生物工程研究所；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，美国Sigma 公司，纯度：99.0%）；乌拉坦（纯度：99.0%）、苏木素（纯度：99.0%）均购于德国Merck公司；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 溶液的制备

2.1.1何首乌提取物的制备 取何首乌药材5 kg，用10 倍量70%乙醇加热回流提取2 次，提取时间分别为2.0、1.5 h，合并提取液，浓缩、干燥，得PWE 粉末，得率为20%。取何首乌药材5 kg，用10倍量蒸馏水加热回流提取2 次，提取时间分别为2.0、1.5 h，合并提取液，浓缩、干燥，得PMW 粉末，得率为25%。精密称取PMW 和PWE 适量，加0.5%的CMC-Na溶液混悬并定容，制成质量浓度为0.6 g·mL-1的PME 混悬液和0.75 g·mL-1的PMW 混悬液（相当于何首乌生药质量浓度为3 g·mL-1），置于4 ℃，备用。

2.1.2ANIT 储备液的配制 精密称取ANIT 适量，加花生油溶解并定容，制成质量浓度为20 mg·mL-1的ANIT储备液，置于4 ℃，备用。

2.2 实验分组及给药

将SD 大鼠随机分为4 组，分别为PMW 组（灌胃给予PMW 15 g·kg-1，20 mL·kg-1，相当于60 g·kg-1生药量，约为临床最大量的110倍）、PME组（灌胃给予PME 12 g·kg-1，20 mL·kg-1，相当于60 g·kg-1生药量，约为临床最大量的110倍）、对照组（灌胃给予同体积0.5%的CMC-Na 溶液）及阳性对照ANIT 组（灌胃给予同体积0.5%CMC-Na溶液，第40天灌胃给予ANIT 储备液100 mg·kg-1，5 mL·kg-1）。每组10只，共40只，连续给药42 d。期间大鼠饮食自由，并观察大鼠的行为活动、外观体征、尿液和粪便形态等。

2.3 生物样品收集

给药结束后，大鼠禁食24 h，分别腹腔注射25%乌拉坦麻醉，由腹主动脉取血，并置于离心管中，待有少量血清析出时，以3000 r·min-1离心10 min（离心半径为8 cm），取血清存于-20 ℃，待测。并立即处死大鼠，取肝脏，切成2 mm×2 mm 的块状，置于10%中性甲醛固定液中固定72 h。

2.4 生物样品处理

2.4.1血清生化指标的测定 取各组大鼠血清样品，根据试剂盒说明书进行操作，采用Multiskan MK3 型酶标仪测定血清生化指标TBIL 和TBA；采用TU-1901 型紫外-可见分光光度计测定血清生化指标AST、ALT 和ALP，并将所测定的结果与对照组进行比较分析。

2.4.2病理检测 大鼠肝脏分离后使用10%中性甲醛固定组织标本。固定后的组织经过修块取材后采用乙醇逐级脱水，再由石蜡包埋，采用滑动切片机切片（厚约3 μm）。最终标本经苏木素-伊红（HE）染色后在光镜下进行组织病理学检查[13]。

2.5 转运体mRAN表达的检测

精密称取大鼠肝脏组织100 mg，剪碎，经RNA提取，RNA 浓度、纯度及完整性的测定，反转录，PCR 扩增等过程。用PCR 仪自带软件进行荧光定量分析，得出循环数阈值（Ct），待测样本目的基因表达数的计算方法用2-ΔΔCt法计算目标基因表达的相对水平[14]。OATP1a1、OATP1b2、MRP2、MRP3、BSEP、P-gp、NTCP mRNA 的引物序列见表1。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）评估相对基因表达，并使用iQ5光学软件标准化为GAPDH水平。

表1 qRT-PCR引物序列

2.6 数据处理

实验数据均采用SAS 9.4统计软件处理，统计检验采用单因素方差分析，数据以（）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠体征变化

与对照组大鼠比较，ANIT组大鼠呈现明显的胆汁淤积样症状，毛发明显变黄，四肢、耳和尾部等毛发较少的地方可见明显变黄，与文献报道一致[15]。与对照组大鼠比较，PMW 和PME 组大鼠毛发变黄而粗糙，且PME 组大鼠四肢、耳和尾部等毛发较少的地方可见明显变黄，呈现出黄疸症状，但症状轻于ANIT组。此外，PMW 和PME组大鼠尿液均呈黄红色，粪便为稀便。

3.2 大鼠灌胃何首乌后血清生化指标的变化

各组大鼠血清生化指标ALT、AST、TBA、ALP 和TBIL 水平见表2。与对照组比较，ANIT 组大鼠的5 项血清生化指标水平均显著升高（P＜0.01），说明该检测方法具有可靠性；PMW 组大鼠血清中AST 水平显著降低（P＜0.05），ALT、ALP水平显著升高（P＜0.05），TBIL、TBA 水平差异无统计学意义，说明大鼠已经出现肝细胞损伤，但TBIL、TBA水平仍未发生明显变化；PME组大鼠血清中AST 水平显著降低（P＜0.05），ALT、ALP、TBA 水平显著性升高（P＜0.01），TBIL 水平差异无统计学意义，说明大鼠肝细胞损伤出现的同时已经表现出胆汁酸代谢异常，提示有发生胆汁淤积的趋势。

表2 PMW和PME对大鼠血清生化指标的影响（, n=10）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 大鼠肝脏组织的病理变化

各组大鼠肝脏染色结果见图1。与对照组比较，PME 组和PMW 组大鼠肝脏均可见胆管增生及炎性细胞浸润，提示2 组大鼠经42 d 诱导后均存在不同程度的肝损伤。其中PME 组大鼠灶性坏死及炎性细胞浸润发生率分别为5/10 和6/10，均高于PMW 组（分别为2/10 和3/10），提示PME 导致的肝脏病变较重。

图1 PMW和PME对大鼠肝脏组织病理学的影响（HE）

3.4 大鼠肝脏转运体mRNA表达变化

大鼠肝脏转运体OATP1a1、OATP1b2、MRP2、MRP3、BSEP、NTCP、BCRP、P-gp 的mRNA 表达结果见图2。结果显示，与对照组比较，PME 组大鼠肝脏组织中MRP2、BSEP、NTCP、BCRP、P-gp mRNA 表达水平均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），OATP1b2、MRP3 mRNA 表达水平升高但差异无统计学意义，OATP1a1 mRNA 表达水平显著升高（P＜0.05）。PMW组大鼠肝脏组织中OATP1a1、OATP1b2、BSEP、NTCP、P-gp mRNA 水平显著升高（P＜0.05，P＜0.01），MRP2、BCRP mRNA 水平均显著降低（P＜0.05），MRP3 mRNA水平差异无统计学意义。

图2 PMW和PME对大鼠大鼠肝脏内转运体mRNA表达的影响（, n=10）

由结果可知PMW 和PME 给药组均可显著降低外排转运体MRP2、BCRP mRNA表达水平，升高摄取转运体OATP1a1、OATP1b2 mRNA 表达水平。对于其他转运体的影响，2 个给药组存在差异，PME可显著降低外排转运体BSEP、P-gp mRNA 的表达水平，下调摄取转运体NTCP的表达。而PMW 可显著升高NTCP、BSEP、P-gp，对MRP3 影响不大。与PMW 组比较，PME 给药组表现出更明显的大鼠肝损伤症状，并伴有胆红素代谢异常及胆汁淤积，可能与促进胆红素、胆汁酸摄取转运而抑制其代谢物外排有关。

4 结论与讨论

ANIT是用于制备胆汁淤积模型的典型药物，可诱导肝损伤，致使肝细胞变性、坏死，同时还导致胆管上皮细胞肿胀坏死，造成胆管阻塞，产生显著的高胆红素血症和胆汁淤积，最终导致一系列血清生化指标发生明显变化[15]。由于其致肝损伤作用显著，因此本研究选取其作为血清生化的阳性对照，于PME 和PMW 组给药第40 天开始给药，持续到第42 天。ALT 与AST 主要分布在肝脏的肝细胞内，肝细胞坏死时ALT 和AST 水平升高，其升高的程度与肝细胞受损的程度相一致，因此是目前最常用的肝功能指标[16]。ALP 是一种磷酸单酯酶，正常情况下，体内ALP 来源于肝脏和骨组织，主要作为阻塞性黄疸、肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查指标，阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎都会使ALP 水平偏高[17]。因而临床上常用这3 个指标作为判断肝损伤及肝损伤类型的标准。当患者出现胆汁淤积时，不仅上述3 个血清生化指标会发生变化，TBA 和TBIL 也会发生明显的变化。TBA 是结合型胆汁酸，健康人的周围血液中含量极微，当肝细胞损害或肝内、外阻塞时，TBA 就会升高，是一项比较敏感和有效的肝功能试验之一[18]。TBIL 是直接胆红素和间接胆红素的总和，TBIL 的升高即是黄疸，主要用来诊断肝脏疾病或胆道异常[19-20]。

本研究发现，PMW 和PME 给药后，PMW 组大鼠血清中仅ALT 和ALP 水平显著升高（P＜0.05），而PME组大鼠血清中ALT、TBA和ALP水平均显著升高（P＜0.01），说明何首乌的2种提取物均对大鼠产生了一定的肝损伤作用，并且PME 组大鼠可能发生了胆汁淤积。有文献报道，王涛等[21]证明高剂量PMW 可导致大鼠ALP 和TBA 水平明显升高，同时可见肝细胞小灶性坏死，认为在不诱发严重肝损伤的前提下PMW 即可引起大鼠胆汁淤积，这与本研究结论相一致。此外，LPS 诱导后的大鼠给予PME后TBIL水平明显降低，ALP水平明显升高[22]。TBIL作为胆红素异常的判断标准，在本研究中并未观察到明显变化，推测这可能与本研究中正常大鼠给药后机体的代偿调节作用有关，使得这一指标的变化在短时期内未能显现出来。另有研究人员发现，PME 给药可使大鼠出现轻微肝细胞变性，但经过LPS 诱导后的大鼠则表现为肝脏严重局灶坏死[22]。本研究病理结果显示，2 种何首乌提取物都会不同程度地引发肝损伤，并且PME 组表现得更为严重，这与文献报道相符。

本研究中转运体mRNA 表达结果显示，PME 对肝脏外排型转运体（MRP2、BSEP、BCRP 和P-gp）mRNA 的表达水平均具有下调作用，对摄取型转运体（OATP1a1 和OATP1b2）及肝血窦侧的外排型转运体（MRP3）mRNA 的表达水平具有上调作用（图3）。因此推测，PME 长期给药后可能会导致胆红素和胆汁酸等内源性小分子在肝内发生蓄积，引起肝损伤。PMW 对肝脏外排型转运体的基因表达既有上调也有下调作用，对摄取型转运体及肝血窦侧的外排型转运体的基因表达具有上调或不变的作用（图3），这与王涛等[23]的研究结果相一致，虽然PMW 对肝脏上的转运体有不同程度的调控作用，但其抑制或激活作用无明显的倾向性。

图3 PME和PMW对转运体的影响

因此，经过长期诱导后，2 种提取物均可导致大鼠发生肝损伤，其作用机制与影响胆红素和胆汁酸相关转运体相关，PME 和PMW 引发肝损伤程度存在差异，原因可能是对具体转运蛋白的作用不同所致。本研究初步推测了PME 和PMW 引发肝损伤的作用机制，为临床安全用药提供了数据支撑。