生炙淫羊藿抗衰老活性比较及作用机制研究△

李丹婷，姜宇，栾雅格，李晴霞，康念欣，谭鹏

北京中医药大学 中药学院，北京102488

淫羊藿主要来源于小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.，箭叶淫羊藿E.sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.，柔毛淫羊藿E.pubescensMaxim.或朝鲜淫羊藿E.koreanumNakai 的干燥叶[1]，主要功效有壮阳、强筋骨等。淫羊藿作为补肾中药，已被不少报道证实具有抗衰老作用[2-3]。淫羊藿炮制方法来自于《雷公炮炙论》[4]，炮制淫羊藿应用油炙法，辅料为羊脂油。有研究发现，油炙淫羊藿较生品更能提高肾阳虚症状模型小鼠的交配能力和耐寒能力，提示炙淫羊藿温肾助阳的功效强于生品[5-6]。因此，推测淫羊藿生品与炮制品的抗衰老作用可能有差异，本研究将观察在生、炙淫羊藿提取物的暴露下，秀丽隐杆线虫（以下简称线虫）的寿命是否有差异，从而对淫羊藿炮制品的抗衰老功效进行初步的区分，以期为淫羊藿的临床合理用药提供参考。同时，本研究利用网络药理学探究淫羊藿抗衰老潜在靶点及相关通路，以期为进一步研究淫羊藿抗衰老原理机制提供理论依据。

1 材料

1.1 实验动物

N2 野生型线虫、大肠埃希氏菌OP50（以下简称OP50）均由中国科学院遗传与发育生物学遗传所惠赠。

1.2 试药

淫羊藿生品饮片（产地为四川，批号为1704058）、羊脂油（产地为河北，批号为2014058）均购自北京市双桥燕京中药饮片厂，经北京中医药大学中药学院杨瑶珺教授鉴别为小檗科植物淫羊藿E.brevicomuMaxim.的干燥叶的炮制加工品，符合《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版规定。

琼脂粉（批号为20200518）、蛋白胨（批号为20181206）、胰蛋白胨（批号为20180206）、胆固醇（批号为160612）均购自北京奥博拓达科技有限公司；氯化钠（批号为20160105）、磷酸二氢钾（批号为20190216）、氢氧化钾（批号为20161124）、磷酸氢二钠（批号为20160216）、氯化铵（批号为20150929）均购自北京化工厂；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；无水乙醇（分析纯，批号为110115）购自天津市致远化学试剂有限公司；二甲基亚砜（天津市光复精细化工研究所，批号为20180320）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；酵母提取物（英国OXOID 公司，批号为1149159）；无氟尿嘧啶（上海麦克林生化技术有限公司，批号为C10238054）。

1.3 仪器

BS210S 型电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；LT-CPS50C型立式高压蒸汽灭菌器[立德泰勀（上海）科学仪器有限公司]；LRH-150型生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；SMZ745T型立式显微镜[尼康仪器（上海）有限公司]；SB25-12 DTD 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；SKG-1601型电磁炉（佛山艾诗凯齐电气有限公司）；LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）。

2 方法

2.1 炙淫羊藿炮制与质量检测

炙淫羊藿由本课题组按照《中国药典》2020 年版[1]炮制方法制备所得，再按照《中国药典》2020年版规定的含量测定方法（通则0512）测定，测得宝藿苷I 质量分数为0.066 6%（≥0.030%）；淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B 和朝藿定C 的总质量分数为2.84%（≥1.2%），表明炮制后所得炙淫羊藿符合《中国药典》2020年版规定。

2.2 线虫的一般培养

线虫以OP50 为食，在无菌环境中，挑取OP50接种于LB 培养基50 mL 中，置于37 ℃恒温培养箱12 h，再置于4 ℃冰箱中保存。取OP50 菌液100 μL涂布于冷却凝固的线虫生长（NGM）培养基上，于干燥处放置12 h即可使用。线虫须在20 ℃恒温培养箱中培养，约3 d传代1次。

2.3 线虫的同步化处理

在无菌的条件下，挑取50～60 条处于产卵期的成虫于1 个新的涂有OP50 的培养基上，待成虫产卵2 h后将其全部挑走。将产卵板置于无菌生化培养箱中20 ℃培养至L4时期。

2.4 含有生、炙淫羊藿药液的OP50制备

将淫羊藿生品粉碎后过三号筛，加10 倍量70%乙醇超声提取1 h，浓缩至无醇味，用2%的二甲基亚砜助溶[7]，加入去离子水分散得到淫羊藿药液，4 ℃下保存。使用时吸取一定量淫羊藿药液，用OP50菌液稀释成所需质量浓度。同法制备含炙淫羊藿药液OP50。

2.5 生、炙淫羊藿对线虫寿命影响研究

将同步化至L4 时期的线虫分成对照组、生品组和炙品组，分别在涂有正常OP50、含生淫羊藿药液的OP50及含炙淫羊藿药液的OP50的培养基中暴露至成虫后，每组随机挑取30条成虫至含有12.5 mg·L-1五氟尿嘧啶的NGM培养基中，继续用药液处理。3 d后转移至NGM培养基中，继续用药液处理。每24 h计数1 次线虫的存活数，直至所有线虫死亡，每组实验平行3次，从卵开始作为寿命实验的第0天。

2.6 生、炙淫羊藿对线虫抗热应激作用研究

将同步化至L4时期的线虫分成对照组、生品组和炙品组，分别在涂有正常OP50、含生淫羊藿药液的OP50及含炙淫羊藿药液的OP50的培养基中暴露至成虫后，温度升高至36 ℃进行热应激反应，温度升高时记为0时，每2 h计数1次线虫的存活数，至所有线虫死亡。每组实验测试30条线虫，平行3次。

2.7 生、炙淫羊藿对线虫产卵数影响研究

将同步化的线虫培养至L4 时期后，分成对照组、生品组和炙品组，再分别在涂有正常OP50、含生淫羊藿药液的OP50 及炙淫羊藿药液的OP50 的培养基中暴露至成虫。随机挑选10 条线虫，在成虫第1 天分别挑取至含有OP50 的培养基中，使其产卵，每隔24 h 给线虫换新的培养基，保留所有产卵后的培养基，2 d后计数孵化的线虫的数量。

2.8 生、炙淫羊藿对线虫体弯曲影响研究

将同步化的线虫培养至L4 时期后，分成对照组、生品组和炙品组，再分别在涂有正常OP50、含生淫羊藿药液的OP50 及炙淫羊藿药液的OP50 的培养基中暴露至成虫。在成虫的第2 天和第8 天挑选15 条转移至没有OP50 的培养皿板中，滴1 滴M9 缓冲溶液（磷酸氢二钠14.6 g、氯化铵10 g、磷酸二氢钾6.8 g、氯化钠0.5 g，加水至1 L），2 min 后，显微镜放大至合适的倍数，记录每条线虫20 s 内身体弯曲（完成1次正弦曲线）的次数。

2.9 统计学方法

2.10 基于网络药理学探究淫羊藿抗衰老机制

利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php），查找淫羊藿的活性成分，调整口服生物利用度（OB）＞30%，类药性（DL）＞0.18，对淫羊藿的活性成分做进一步筛选。再通过主要活性成分的MOL ID，利用TCMSP 的相关靶点的检索功能（Related Targets），依次得到其对应的潜在作用靶点，并且应用UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/），输入靶点名称，限定物种为“智人”，检索得到靶点名称对应的Gene symbol。以“anti-aging”为关键词，在GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）中检索已认证的与抗衰老相关的基因。将淫羊藿活性成分靶点和与衰老相关作用靶点取交集，找出淫羊藿抗衰老的潜在作用靶点，利用微生信网站（http://www.bioinformatics.com.cn/）做韦恩图，并用Cytoscape v3.6.1 软件构建淫羊藿活性成分-抗衰老靶点网络图。

将上述得到的淫羊藿活性成分靶点和与抗衰老相关作用靶点的交集输入STRING 数据库（https://string-db.org/），选择物种为“人”，并限定交互作用＞0.4，构建淫羊藿抗衰老靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。将在STRING 数据库中构建的PPI 网络数据导入Cytoscape 3.6.1 软件中，调整Betweenness Centrality 值、Closeness Centrality 值 和Degree 值筛选出核心作用靶点，并构建核心靶点网络图。

将共有抗衰老靶点导入Metascape数据库（http://metascape.org/），进行基因本体（GO）功能富集和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。限定物种为“智人”，设定阈值P＜0.05，即得到功能富集分析中生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞组成（cellular component，CC）及KEGG 通路富集分析结果。再通过微生信网站将其结果可视化。

3 结果

3.1 生、炙淫羊藿对线虫寿命影响研究

通过预实验确定生药质量浓度64 mg·mL-1为最佳给药浓度。将其对线虫寿命的影响结果绘制成存活率曲线图（图1）。由图1 可看出对照组线虫的最大存活时间为22 d，淫羊藿生品组最大存活时间为21 d，淫羊藿炙品组最长存活时间为27 d，经对数秩检验（Log-rank）分析可知炙品组与对照组线虫寿命存活曲线差异具有统计学意义（P＜0.05）。表明此质量浓度下，炙淫羊藿能够明显延长线虫的寿命。

3.2 生、炙淫羊藿对线虫抗热应激作用研究

如图2 所示，热应激下对照组线虫最长存活时间为7 h，淫羊藿生品、炙品组线虫最长存活时间分别为8、9 h，差异无统计学意义，表明此质量浓度下，生、炙淫羊藿对线虫抗热应激无明显作用。但炙品组的平均存活时间大于生品组和对照组。

图2 线虫抗热应激实验存活率曲线

3.3 生、炙淫羊藿对线虫产卵数影响研究

测定每组线虫的产卵数结果见图3，生、炙淫羊藿组与对照组差异无统计学意义，表明此质量浓度下，生、炙淫羊藿对线虫生殖功能无明显作用。

图3 线虫产卵数实验（, n=10）

3.4 生、炙淫羊藿对线虫体弯曲影响研究

线虫一般情况下会做正弦运动，其运动频率会随生存时间的延长而下降。本实验测定其成虫后第2天和第8天的体弯曲频率，如图4A所示，在第2天用生、炙淫羊藿药液处理后线虫的运动频率与对照组差异无统计学意义；如图4B，暴露至第8 天，与对照组比较，淫羊藿生、炙品组均能提高线虫的体弯曲数，并且与对照组的差异均具有统计学意义（P＜0.05），表明生、炙淫羊藿都能增加老年线虫的体弯曲率。生品组和炙品组两者差异无统计学意义。

图4 生、炙淫羊藿对不同生存时间线虫体弯曲影响（,n=15）

3.5 基于网络药理学探究淫羊藿抗衰老机制

3.5.1淫羊藿的活性成分及作用靶点 从TCMSP中筛选得到淫羊藿的活性成分23 种，其对应的靶点有214个。通过GeneCards检索筛选，获取相关性得分＞5 的与抗衰老相关的靶点有512 个。取淫羊藿活性成分靶点和与抗衰老相关靶点的交集，并用微生信网站做韦恩图（图5），共同靶点有58个，与之相关重要的活性成分有6个（表1）。

表1 淫羊藿关键活性成分

图5 淫羊藿活性成分-抗衰老靶点韦恩图

3.5.2活性成分-靶点网络构建 用Cytoscape

3.6.1 软件构建淫羊藿活性成分-抗衰老靶点网络图（图6），共有64 个节点，58 条边。6 种活性成分中，作用靶点较多的3个成分槲皮素（38个靶点）、8-(3-methylbut-2-enyl)-2-phenyl-chromone（14个靶点）和1,2-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propan-1,3-diol（3 个靶点）可能为淫羊藿抗衰老的关键活性成分。这表现出淫羊藿抗衰老机制具有的多活性成分、多靶点共同作用的特点。

3.5.3PPI 网络构建与分析 PPI 网络见图7，共有58 个节点，744 条边，平均节点度为25.7，平均局部聚类系数为0.781。其节点代表潜在靶点，节点与节点之间的连线代表蛋白质与蛋白质有相互作用，节点大小和颜色随Degree 值调整，Degree 值越大，节点越大、颜色越偏向暖色；节点之间的连线随两节点作用强弱调整，作用关系越强，连接线越粗、颜色越偏向冷色。再通过Cytoscape 3.6.1 软件筛选出核心靶点做成PPI 核心靶点网络图（图8），节点和连线的大小及色调同图7，可见蛋白激酶B1（Akt1）、细胞肿瘤抗原p53（TP53）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、半胱天冬酶-3（CASP3）、Myc 原癌基因蛋白（MYC）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、转录因子AP-1（JUN）、白细胞介素-6（IL-6）、雌激素受体1（ESR1）、肿瘤坏死因子（TNF）等靶点位于网络的核心位置，在PPI 网络中发挥关键调控作用。

图7 淫羊藿与抗衰老交集靶点PPI网络

图8 淫羊藿与抗衰老交集靶点的核心蛋白相互作用图

3.5.4GO 与KEGG 通路富集分析 利用Metascape数据库，将58 个交集靶点GO 富集分析，设置P＜0.05 筛选条件，得到16 个BP 条目、14 个CC 条 目、20 个MF 条目。采用微生信网站将排名靠前的条目绘制条形图（图9）。GO 分析显示，这些靶点在BP方面涉及对无机物的反应（response to inorganic substance）、对生长因子的反应（response to growth factor）、血管发育（blood vessel development）、凋亡信号通路（apoptotic signaling pathway）、细胞死亡的正性调节（positive regulation of cell death）等生物过程。CC 方面涉及膜筏（membrane raft）、纺锤（spindle）、质膜蛋白复合物（plasma membrane protein complex）、胞质核周区域（perinuclear region of cytoplasm）、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物（RNA polymerase Ⅱtranscription factor complex）等部位。MF 方面涉及转录因子结合（transcription factor binding）、激酶绑定（kinase binding）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）、磷酸酶绑定（phosphatase binding）、激酶调节活动（kinase regulator activity）、蛋白质同源二聚化活动（protein homodimerization activity）、脂质结合（lipid binding）、组蛋白脱乙酰酶结合（histone deacetylase binding）、蛋白酶绑定（protease binding）、细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、酶激活活动（enzyme activator activity）等功能。

图9 淫羊藿与抗衰老交集靶点的GO富集分析

KEGG 共富集到225 条通路，设置P＜0.05 筛选条件，共得到20 条通路，筛选靠前的通路绘制气泡图（图10）。结果显示淫羊藿抗衰老的靶点主要涉及癌症通路（30 个，51.72%）、乙型肝炎（20 个，34.48%）、流体剪切应力与动脉粥样硬化（19 个，32.76%）、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终产物受体（AGE-RAGE）信号通路（17个，29.31%）、胞内磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路（17 个，29.31%）、癌症中蛋白聚糖（16 个，27.59%）、铂耐药性（12 个，20.69%）、类风湿性关节炎（8 个，13.79%）、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路（7个，12.07%）、癌症中的转录失调（7个，12.07%）等信号通路。

图10 淫羊藿与抗衰老交集靶点的KEGG通路富集分析

4 讨论

淫羊藿通过延长寿命、抗应激，保护生殖、神经系统等组织器官等方式来实现抗衰老的作用。有研究发现淫羊藿能通过改善肌肉萎缩、减缓有关肝脏衰老症状、恢复衰老小鼠睾丸功能抗衰老作用[8-9]。此外，有实验研究表明炮制淫羊藿时，其有效成分异戊烯基黄酮类成分可能会发生氧化、环合、酯化等反应[10]。这些有效成分的变化可能会促使抗衰老作用的发生。

本研究比较淫羊藿炮制前后对线虫抗衰老作用的差异，从抗衰老角度阐释了淫羊藿炮制增效的科学内涵。结果显示，生、炙淫羊藿能延缓线虫的衰老，且炙淫羊藿延长线虫寿命的作用优于生淫羊藿；生、炙淫羊藿均能提高老年线虫的体弯曲率，表明生、炙淫羊藿对老年线虫的体弯曲均有改善作用。有研究表明，淫羊藿总黄酮可延缓线虫衰老且不损害其生殖功能，且能显著提高其抗热应激的能力[2]。本研究采用生、炙淫羊藿饮片醇提并给药，其成分复杂且成分之间相互作用，更还原临床药效，更能科学地阐释淫羊藿炮制前后的抗衰老作用及差异。在本研究前期，通过参考文献[7]选择含生药量4、32、40、64 mg·mL-1的生、炙淫羊藿药液进行预实验，经过筛选最终确定了寿命实验中淫羊藿炙品组与对照组差异有统计学意义的给药质量浓度64 mg·mL-1进行后续实验。结果显示，在此实验浓度下，实验组和对照组相比，线虫的产卵量差异无统计学意义，表明该质量浓度下淫羊藿和炙淫羊藿药液对线虫的正常发育繁殖无影响，综合寿命实验结果表明在该浓度下，炙淫羊藿能在不影响线虫正常繁殖能力的情况下延长其的寿命，发挥抗衰老作用。

此外，本研究利用网络药理学筛选得到潜在关键活性成分有槲皮素、8-(3-methylbut-2-enyl)-2-phenylchromone、1,2-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propan-1,3-diol等6 种成分。有研究表明，淫羊藿总黄酮可通过抗氧化、抗炎、促进细胞增殖等多方面延缓衰老[3]，其中淫羊藿苷可通过影响神经、免疫、内分泌、生殖等系统发挥抗衰老作用[11]，高剂量的槲皮素能显著延长线虫的平均寿命[12]。而本研究还预测出其他几种潜在抗衰老关键成分，但相关报道较少，可为后续淫羊藿抗衰老成分研究提供参考。通过网络药理学，本研究筛选出了关键蛋白Akt1、TP53、MAPK1、CASP3、MYC、MAPK8、JUN、IL-6、ESR1、TNF 等。研究发现，AKT1[13]、TP53[14]蛋 白可以通过PI3K-Akt 信号通路参与抗衰老过程，CASP3[15]蛋白与细胞凋亡相关，MYC[16]、JUN[17]、IL-6[18]和TNF[18]蛋白与抗衰老相关。同时，本研究预测了淫羊藿抗衰老的相关通路，分别是癌症通路、乙型肝炎、流体剪切应力与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、PI3K-Akt信号通路、癌症中蛋白聚糖、铂耐药性、VEGF 信号通路、癌症中的转录失调等。研究表明，晚期糖基化终末产物/晚期糖基化终产物受体/核转录因子-κB（AGEs/RAGE/NF-κB）通路可能与老年性骨质疏松症发病有关[19]，PI3K-Akt 信号通路的激活可减缓H2O2诱导的心肌细胞衰老[20]，沉默血管内皮细胞生长因子受体1（VEGFR1）可能会促进人β淀粉样蛋白1-42（Aβ1-42）诱导的人脑微血管内皮细胞衰老及凋亡[21]。由此可进一步探讨淫羊藿的抗衰老作用是否与上述潜在靶点及通路有关，从而进行淫羊藿抗衰老作用机制的深入研究。