基于质量源于设计理念和信息熵赋值法优化枸杞子抗氧化功能性提取物的工艺△

侯宪捷，曾文俊，丁建宝，李艳萍，马建龙，杨锐，杨晋，4*

1.北方民族大学 化学与化学工程学院，宁夏 银川 750021；

2.国家民委化工技术基础重点实验室，宁夏 银川 750021；

3.宁夏五行科技有限公司，宁夏 银川 750002；

4.宁夏天然药物工程技术研究中心，宁夏 银川 750021；

5.宁夏大学 化学化工学院，宁夏 银川 750021

中药作为我国独特的医疗卫生资源，在保障人民健康方面发挥着不可替代的作用。但中药生产过程中的不确定性、质量控制的复杂性，以及长期以来产品质量依靠终端检验，忽略了对原料质量属性和生产工艺过程的理解，造成中药制剂的质量不稳定[1-2]。因此，提升和稳定产品质量、加速中药生产工艺的标准化、促进中药工业向现代化科技升级，需要更加科学和系统的方法。

质量源于设计（QbD）理念是目前国际公认的先进控制理念，是一种以预期目标为导向、基于系统性风险管理的开发方法[3]。该理念将质量控制重心转移至原料控制和生产过程控制，通过评估可能影响质量的变量，确定有针对性的策略，使产品质量始终处于可接受的范围，为药品质量的风险管理和持续改进提供了方法[4-5]。在QbD 理念指导下，可以通过以下策略对全过程进行风险防控，明确各工艺所影响的质量标准，进而实现产品的质量稳定性和可控性：1）确定关键质量属性（CQAs）；2）辨识关键原料属性（CMA）和关键工艺参数（CPPs）；3）建立关键工艺单元数学模型；4）构建工艺稳定的设计空间；5）不断改进控制策略[6-11]。

枸杞子为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarumL.的干燥成熟果实，具有滋补肝肾、益精明目的功效[12]。现代研究认为，枸杞子通过抗氧化来实现长寿[13-14]。大量的研究结果表明，枸杞子的抗氧化活性是枸杞多糖和小分子化合物的协同作用[15-18]，提取方法不同可能会影响提取物的抗氧化活性[17-18]。因此，以抗氧化活性为CQA，在QbD 理念指导下，研究和优化枸杞子抗氧化功能性提取物（AOE）的工艺，建立数学模型并确定设计空间，制定提取工艺的控制策略，为开发以生物活性为导向的枸杞子提取物工艺优化和控制方法提供参考。

中药“形之于外”的药性是药材整体化学物质群综合生物效应的体现[4]。前期的研究也表明，枸杞子中小分子化合物以不同途径发挥抗氧化作用[19]。以单一指标作为CQA 来评价制备工艺的优劣具有片面性，大多研究选取多个指标成分，再通过主观或客观赋权法得到综合评价指标，对中药提取工艺进行优化[20-21]。主观赋权法主要根据经验进行判定，受研究者的主观影响大[22]。客观赋权法经过对实验数据的整理、计算和分析，得到权重系数，数据可靠性更高[23]。信息熵作为一种广泛使用的客观赋权法，能清晰地反映实验数据的客观规律、降低了主观因素对实验结果的影响，已经在多种中药提取工艺优化研究中取得良好的效果[21,23-28]。

本研究采用信息熵理论，计算枸杞子提取物体外铁离子还原能力（FRAP）、清除2,2′-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐自由基（ABTS）和羟自由基（OH·）能力的信息熵和权重系数，确定提取物体外抗氧化能力（M），结合总固形物质量，作为CQAs；在QbD 理念指导下，析因分析初步筛选CPPs，通过Box-Behnken 设计建立CQAs 和CPPs 之间的数学模型，建立并优化AOE制备工艺的设计空间，在保证产品质量的前提下，获得最优工艺参数，为大工业生产和制备工艺的标准化和规范化提供参考。

1 材料

1.1 仪器

FD-1C-50 型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；手动移液器（德国Eppendorf 公司）；Multiskan FC 型酶标仪（美国Thermo Fisher 公司）；FA2004 型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）。

1.2 试药

2,4,6-三(2-吡啶基) 三嗪（TPTZ，批号：190516）、ABTS（批号：190826）购于上海泰坦科技有限公司；三氯化铁（FeCl3）六水化合物（批号：180615）、冰醋酸（批号：170823）、过硫酸钾（K2SO4批号：190816）、硫酸亚铁（FeSO4）七水合物（批号：200425）购于天津市大茂化学试剂厂；盐酸（纯度：36%）、水杨酸（纯度：99%）、过氧化氢（H2O2，纯度：30%）购于国药集团化学试剂有限公司；维生素C（批号：190315，上海泰坦科技有限公司）。

枸杞子购于宁夏中宁县，经宁夏农林科学院李彦龙高级工程师鉴定为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarumL.的干燥成熟果实，样品保存于北方民族大学。

2 方法与结果

2.1 样品的制备

称取枸杞子20.0 g，以去离子水为提取溶剂，采用水提法，滤过，合并提取液，减压浓缩，定容至100 mL 量瓶中，从中精密吸取浓缩液，冻干后，即为样品，待测。

2.2 抗氧化能力测定

供试品溶液的制备：取枸杞子提取物样品200 mg，以去离子水溶解并定容至10 mL 量瓶中，摇匀，稀释成质量浓度分别为20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 mg·mL-1的溶液。

2.2.1FRAP测定 FRAP工作液配制：将0.3 mol·L-1醋酸缓冲液、10mmol·L-1TPTZ溶液、20mmol·L-1FeCl3溶液以10∶1∶1混合，即得工作液。

FRAP 测定：分别吸取不同质量浓度供试品溶液0.2 mL 于试管中，并加入工作液3.9 mL。在37 ℃下孵育10 min后，在593 nm处测定吸光度，每组平行3 次，以维生素C 溶液为阳性对照。在FeSO4标准曲线中计算供试品溶液对应的FeSO4浓度[29-30]，方程为Y=1.018 5X+0.062 2（r=0.999 8）。

2.2.2ABTS 自由基清除能力测试 ABTS 基液的配制：将7 mmol·L-1的ABTS溶液和2.45 mmol·L-1的K2SO4溶液以1∶1 混合，于暗处孵育12～16 h，即得。

ABTS工作液的制备：将ABTS基液用去离子水稀 释（20～40 倍）至波长734 nm 处吸光度为（1.000±0.005），即得。

ABTS 自由基清除能力测试：取不同质量浓度供试品溶液0.2 mL 于试管中，加入工作液3.9 mL，室温下孵育5 min，测量反应混合物在734 nm 处的吸光度，去离子水做空白对照，以维生素C 溶液为阳性对照，并计算1/半数抑制率（IC50）[31-32]。

2.2.3OH·清除能力测试 按照顺序依次加入供试品溶液0.2 mL，9 mmol·L-1FeSO4溶液、9 mmol·L-1水杨酸溶液各1 mL于试管中，然后加入8.8 mmol·L-1H2O2溶液1 mL 启动反应。37 ℃孵育30 min，于510 nm 处测定反应溶液的吸光度，去离子水做空白对照，以维生素C溶液为阳性对照，并计算1/IC50值[31,33]。

2.3 信息熵赋值法综合评价提取物的M

首先建立原始数据矩阵，经过归一化处理之后得到指标概率矩阵，然后计算出各指标的熵和权重系数，某一项评价指标下的数据之间差异性越大，熵越小，权重系数反而越大，最后将指标概率矩阵中的数据加权处理，即可得到综合评价指标[23-24]，具体步骤如下。

1）建立原始矩阵(Xij)mn。

xij表示第j次实验时第i个评价指标的取值。

2）将原始矩阵X转化为指标概率矩阵(Pij)mn。

3）计算第i个评价指标的信息熵（H）。

4）计算第i个评价指标的权重（W）。

5）依据各指标的W，计算M。

2.4 总固形物质量测定

按照《中华人民共和国药典》2020 年版（四部）“2201 浸出物测定法”项下方法测定，精密量取枸杞子提取液5 mL，置于已经干燥恒重的蒸发皿中，在水浴蒸干后，于105 ℃下干燥3 h，置于干燥器中放置30 min，迅速精密称定质量，计算总固形物质量[34]。

2.5 CQAs和CPPs水平的筛选

以工艺可控性较强的料液比（A）、提取次数（B）、提取时间（C）、提取温度（D）为考察因素，各因素水平见表1，采用24-1分式析因设计筛选CPPs，实验设计见表2，每种设计组合重复2次，结果见表3。

表1 枸杞子提取工艺因素水平

表2 AOE的提取工艺24-1分式析因设计及各批次FRAP、ABTS IC50、OH·清除能力IC50、总固形物和M值

2.6 CQAs和CPPs水平的模型建立

为确立提取工艺中CQAs 和CPPs 的相关性，设计四因素三水平的Box-Behnken 试验，因素水平见表4、结果见表5。通过Design Expert 10.0.7软件进行拟合，得到回归模型M值：Y1=0.031+5×10-4A-5.833×10-4B+1.667×10-4C+8.917×10-4D+5×10-4AB+5×10-4AC -1×10-3AD+1×10-3BC+7.5×10-4BD+2×10-3CD+1.642×10-3A2+1.017×10-3B2-1.608×10-3C2+7.767×10-3D2，（r=0.949 3）；总固形物：Y2=11.90+1.45A+2.85B+0.63C-0.049D-0.84AB-0.65AC-1.77AD+0.46BC-0.54BD+0.64CD-8.883×10-3A2-2.41B2-0.58C2+1.35D2（r=0.867 8，RAdj2=0.735 7）。方差分析见表6，由表6 可知D 对抗氧化能力具有统计学意义（P＜0.000 1），B 对总固形物质量具有统计学意义（P＜0.000 1）；BD 与CD 对抗氧化能力影响稍强，AB 与AD 对总固形物质量影响稍强。三维响应面图见图1～2。由图1可知，随着温度的上升抗氧化能力上升明显，其余参数无明显变化。由图2可知，随料液比、温度的上升固形物含量上升，当提取次数达到一定程度时，固形物含量上升缓慢。

图1 AOE的M三维响应面图

图2 AOE总固形物质量三维响应面图

表4 AOE Box-Behnken因素水平

表5 AOE Box-Behnken试验设计

表6 AOE Box-Behnken试验设计分析结果

2.7 设计空间的建立、优化及验证

通过Design Expert 10.0.7 软件建立显著影响因素B、D的设计空间，将优化目标定位总固形物质量＞11 g（＞44%），M＞0.032。但由于模型预测值与真实值之间存在一定的误差，可能导致设计空间的边界具有不确定性，故在定义设计空间参数时加入置信水平α=0.05 的置信区间，结果应用Overlay Plot 展示，将A 固定为高水平，在不同水平C 下的设计空间，结果见图3。可以看出，C在2 h设计空间的自由度最大。将2个设计空间重叠，图4中交叉区域即为操作空间。结合实际情况选取3个操作空间内的优选点进行放大10倍验证实验，3个验证点的选取及验证

图3 AOE设计空间随提取次数和提取温度的变化趋势

图4 AOE设计空间图

注：*P＜0.05,**P＜0.01。实验结果见表7。其中抗氧化活性测试RSD＜3%，总固形物质量RSD＜5%。由表7可知，预测值与实际值较为接近，表明该模型的适应性较好。

表7 AOE设计空间试验结果验证

3 讨论

本研究以QbD 理念为基础，采用信息熵理论综合多个评价指标，对AOE 工艺进行优化。枸杞子中含有丰富的黄酮、类胡萝卜素及绿原酸等物质和多糖，由于不同工艺制备的提取物中这些天然抗氧化剂的含量不同，进而提取物表现出不同的抗氧化活性。因此，笔者选取FRAP测试、ABTS自由基清除能力和OH·清除能力来测试不同提取物的抗氧化活性，并通过信息熵理论对3 种抗氧化测试进行综合评价。通过1 个指标综合反映提取物的M，与总固形物质量一同作为CQAs。采用24-1分式析因设计筛选CPPs。从表3 可以看出，提取温度对于抗氧化活性具有统计学意义（P＜0.01），料液比和提取次数对于固形物具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。因此，将料液比、提取次数、提取温度作为CPPs。CQAs 和CPPs 之间数学模型的建立可以反映出两者的相互关联，揭示不同CPPs 对CQAs 所造成的影响，增强对工艺过程的理解，为之后的工艺优化和控制策略建立提供参考。

通过Box-Behnken 设计建立CPPs 对CQAs 的数学模型，拟合出两者之间关系的响应面，以此描述CPPs对CQAs的影响效应。由表5～6可知，M和总固形物质量这两种模型具有统计学意义（P＜0.000 1，P＜0.00 1）；失拟项的P值均大于0.05，表明两种模型均可以接受；r分别为0.949 3 和0.867 8，RAdj2分别为0.898 5 和0.735 7，表明两种模型与数据拟合度良好。其中，提取温度对M的影响十分显著，其余参数并无显著影响；提取次数对总固形物质量具有显著影响，而料液比与提取时间之间的交互作用对总固形物质量的影响相对较弱。根据两个回归方程进行绘图分析，由图1～2 可知，提取温度对应的曲面坡度较陡，提取次数对应的曲面坡度比较平缓，表明提取温度对信息熵M值的影响显著；随着提取次数的增加，总固形物质量增加；总固形物质量随料液比的增加也有所上升，而随提取温度变化不明显。在析因分析和方差分析中均显示，提取温度对抗氧化能力有显著性影响，提取次数对总固形物质量有显著影响。在枸杞子水提物中，主要成分为枸杞多糖，其次为酚类、黄酮类等物质，这些物质具有较高的抗氧化活性；其扩散系数随温度升高而升高，进而使水提物的抗氧化活性增强[35-39]。有研究显示，在料液比达到1∶20时，枸杞多糖的提取率达到最大并趋于平缓。本研究中料液比远远小于1∶20，枸杞多糖的溶解度比较低，而枸杞水提物中多糖的质量分数高达97.54%，因此，增加提取次数可以显著提升总固形物的含量[39-40]。

设计空间被定义为能够保障产品质量的输入变量和工艺参数的多维空间组合与相互作用，并不是一个固定的参数[41]。由图3可以看出，两者皆是在料液比为1∶8、提取时间2 h 时表现出最大的自由度。因此，将两者重叠，交叉区域为同时满足2种条件的设计空间，即图4中交叉区域。通过放大10倍对设计空间的验证表明，基本符合优化目标。设计空间的准确与否取决于CQAs 和CPPs 之间的数学模型是否准确，建立更加精准的数学模型直接影响设计空间是否可靠。因此，选用合适的工具预测CQAs 与CPPs 在工艺过程中的质量传递规律，可以构建出更加稳定、精确的设计空间。此外，设计空间并不是稳定不变的，设计空间的建立是一个长期的过程，在产品的整个生命周期中，随着工艺研究的不断深入，所获取的新的知识可被用来不断改进设计空间[42]。

控制策略是在对当前产品和过程充分理解的基础上，制定出一套行之有效的控制方案，其目的是保障产品的质量和性能。上述提取工艺研究表明，提取次数和提取温度这2 个CPPs 对提取工艺有显著性影响，对CPPs 的有效控制是保证产品质量稳定、可控的关键。在提取过程中提取次数对总固形物的含量影响较大，可适当增加提取次数来获得较多的总固形物。图2 表明，当提取次数较低时，可适当增加料液比来补偿提取液中总固形物质量的下降。而提取温度的控制，对于制备物体外抗氧化活性的影响较为显著，可以采用控温性能良好的设备对温度进行实时监控。