甘草粉末粒度分布与其品质的相关性研究△

李锬，王升，田壮，尚兴朴，李鹏英，吕朝耕，康传志，万修福，周利，郭兰萍，王瑞杉*

1.中国中医科学院 中药资源中心 道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700；2.中国中药有限公司，北京 102600

甘草始载于《神农本草经》，列为上品，为豆科多年生植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、胀果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根茎，味甘，性平[1]，可补脾益气、清热解毒、润肺止咳，能够调和诸药，故有“国老”之称。甘草酸和甘草苷是甘草的主要活性成分，具有镇咳、消炎、解毒、抗菌、抗肿瘤、抗病毒、调血脂和抗动脉粥样硬化等药理作用[2-3]。另外，甘草具有较强的抗旱、抗寒、耐盐碱和防风固沙能力[4]，还广泛应用于食品、饮料和化妆品等行业[5-6]。随着国内外市场对甘草资源需求量的增加，野生资源迅速枯竭，目前市场上甘草药材多为人工种植，由于地理环境的差异、种植不规范导致其质量良莠不齐[7]。

传统观点认为甘草以粉性为佳[8-9]，《本草品汇精要》称：“根坚实有而肥者为好”[10]。《本草从新》记载：“大而结者良，出大同，名粉草（弹之有粉出），细者名统草”[11]。甘草粉性通常量化为淀粉含量或显微镜下淀粉粒数目，认为淀粉含量越多则甘草品质越好。但关于甘草粉性与淀粉含量、淀粉粒特征的研究表明，甘草淀粉含量与有效成分含量往往呈负相关[12-13]。其中Liu 等[13]研究发现甘草的粉性与甘草酸、甘草苷的含量，直链淀粉与总淀粉的比例及粒径超过5 μm 的淀粉粒数量呈正相关，与总淀粉含量呈负相关。以“粉性”等传统性状鉴别评价甘草品质受到了挑战，亟需更为准确的方法诠释甘草粉性的量化标准和科学内涵。

近年来，激光衍射已经成为普遍认可的粉体表征技术，在食品、医药、化工、农业等领域得到广泛应用。激光衍射粒度分析仪具有测量速度快、测量过程自动化程度高、衍射谱仅与颗粒大小有关等优势[14]，尤其重要的是激光衍射可以通过表征粒度分布鉴别不同样品，并解释样品的独特品质。例如，不同种类咖啡产品研磨后咖啡粉粒度分布情况明显不同，精细咖啡粉在冲泡时可以产生独特的苦味，而随着咖啡粉粒径的增加，产品的口感则逐渐顺滑[15]。中药材活性成分在不同组织中含量存在差异，会导致其粉体粒径大小、形状、表面特征等颗粒学性质不完全相同，如易碎组织在粉碎过程中易形成小颗粒，不易粉碎的组织则在大颗粒粉末中较多[16]。因此，可将激光衍射粒度分布检测技术用于鉴别具有组织特性差异的药材，也可将粒度分布与药效成分含量进行关联，以期来量化对药材品质的评价。

本研究以甘草为材料，建立检测甘草粉末粒度的方法。利用粉末粒度分布表征甘草粉体特征，同时以甘草酸和甘草苷类化合物的含量表征不同产地甘草的品质优劣，通过分析甘草粉末粒度分布与甘草有效成分含量之间的相关性，为快速、准确评价甘草品质特征提供理论指导，同时也为粒度分析仪在中药领域的应用提供参考。

1 材料

1.1 试药

实验样品收集于新疆、内蒙古、甘肃3 个省（自治区）21 个产地（县/市）药材收购商/合作社，共40份，包括10个甲等、18个乙等、12个丙等，均为秋季采收，3年生样品，经中国中医科学院中药资源中心王升副研究员鉴定为豆科植物乌拉尔甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根茎。具体信息见表1。

表1 甘草样品信息

对照品皂苷类化合物22-β-乙酰氧基-甘草酸（1，批号：J24GS147479）、甘草皂苷G2（2，批号：Z29J11H119881）、甘草酸（3，批号：Y30J11Q119843）和黄酮苷类化合物甘草苷元-7,4'-二葡萄糖苷（4，批号：G09J11Y111183）、芹糖甘草苷（5，批号：Z29J11H117017）、维采宁（6，批号：J24GS158679）、甘草苷（7，批号：Z29J11H107681）、黄甘草苷（8，批号：Y30J11Q617243）、芒柄花苷（9，批号：G09J11Y517183）、芹糖异甘草苷（10，批号：J24GS532509）、异甘草苷（11，批号：Y30J11Q117543）均购自云南西力生物技术股份有限公司，纯度均大于95%；实验用乙醇、甲醇、乙腈均为色谱纯；水为实验室自制超纯水。

1.2 仪器

Mastersizer 2000 型激光衍射粒度分析仪（马尔文帕纳科公司）；ACQUITY UPLC H-CLASS 系统，ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），VanGuard预柱（5 mm×2.1 mm，1.8 μm）均购于美国Waters 公司；FW177 型中药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；ML104T/02型电子天平（梅特勒-托利多公司）；Pacific TⅡ型超纯水系统（赛默飞世尔科技有限公司）；SB-800 DTD型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 样品处理

甘草样品干燥，称取样品约250 g，于中药粉碎机粉碎2次、每次1 min，过二号筛[（850±29）μm]。

2.2 甘草粉末粒度检测

按照仪器默认的土壤设定参数，蓝光折射率设为1.336，残差均小于0.5%，遮光度为1.5%～4.5%。将烧杯中加满蒸馏水，超声3 min，排除仪器气泡，防止影响测量结果。将甘草粉末加入测量烧杯中稀释至粒度仪测量所需的体积占比（7%～15%），待溶液稳定且没有粉末沉淀时，边超声边进样测量。

2.3 有效成分含量测定

含量测定参考文献[17]方法，根据化合物类型（甘草酸类和甘草苷类）分别进行检测。该方法在包括回收率、重复性及稳定性在内的方法学验证实验中均表现出良好的可靠性。

2.3.1 甘草酸类3 种皂苷类化合物（1～3）的检测方法 称取甘草粉末200 mg于50%甲醇10 mL，25 ℃超声提取30 min。流动相为乙腈-甲醇（4∶1，A）和0.1%甲酸水溶液（B），洗脱梯度（0～1.0 min，30%A；1.0～8.0 min，30%～40%A；8.0～16.0 min，40%～52%A；16.0～16.2 min，52%～100%A；16.2～17.6 min，100%A）；流速0.40mL·min-1，柱温55 ℃，进样量1 μL，样品盘温度15 ℃，全波长扫描190～600 nm，定量分析检测波长254 nm。

对照品溶液的配制：化合物1、2 溶于50%甲醇，化合物3 溶于适量75%甲醇，配制质量浓度为5 mg·mL-1的储存液。用50%甲醇将化合物1和2稀释至0.5 mg·mL-1，化合物3 稀释至2.5 mg·mL-1，再按照1、1.25、2.5、5、10、20、40、80 和160 的稀释因子进行稀释，以峰面积为Y，各个化合物进样质量（g）为X，获得标准曲线。

2.3.2 甘草苷类8种黄酮苷类化合物（4～11）的检测方法 按2.3.1项下方法提取样品。流动相为乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～1.0 min，10%～15%A；1.0～6.0 min，15%～25%A；6.0～8.5 min，25%～30%A；8.5～10.0 min，30%～32%A）；流速为0.30 mL·min-1，化合物10 和11 检测波长365 nm，化合物4～9检测波长270 nm。

对照品溶液的配制：化合物4～11均溶于适量50%甲醇至质量浓度为3 mg·mL-1的储存液，用50%甲醇分别稀释化合物4～6和8到使用质量浓度0.18 mg·mL-1，化合物7、9～11质量浓度为0.42 mg·mL-1，再按照1、1.25、2.5、5、10、20、40、80和160的稀释因子进行稀释，以峰面积为Y，各个化合物进样质量（g）为X，获得标准曲线。

2.4 数据分析

使用IBM SPSS 19.0 统计软件对各化合物含量与甘草粉末粒度的相关性进行统计分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 甘草粉末粒度检测结果

典型差异甘草样品检测结果见表2，计算出粉末样品中粒径在0.01～2.00、2.00～20.00、20.00～50.00、50.00～100.00、100.00～200.00、200.00～250.00、250.00～500.00、500.00～1000.00、1000.00～2000.00 μm 的体积占比，即粉末样品的粒度分布，以此来表征甘草粉末的粉体特征。可见不同产地甘草样品粒度分布存在明显差异。

表2 甘草粉末粒度分布 %

40 份甘草粉末样品的粒径分布在2.00～20.00、20.00～50.00、50.00～100.00、100.00～200.00、250.00～500.00、500.00～1000.00 μm 几个区段内的粒子体积占比较大（均值＞10%），且在40 个样品当 中 2.00～20.00、50.00～100.00、100.00～200.00、500.00～1000.00 μm 几个区段内的粒子分布体积的波动较大（波动＞10%），见表2。这些甘草粉末样品在这些区段的分布可能与甘草的粉体特征和品质有关联。

3.2 有效成分含量测定结果

3.2.1 标准曲线 各化合物质量浓度及色谱峰面积线性关系良好，见表3。

表3 甘草各化合物标准曲线的回归方程

3.2.2 有效成分含量 《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版规定，甘草中甘草酸质量分数不得低于2%、甘草苷质量分数不得低于0.5%，根据测量值，40批甘草中甘草酸不合格率为32.5%，甘草苷不合格率为35.0%。甘草酸不合格的样品产地主要集中在新疆，包括新疆29 团、30 团、和硕、精河、轮南和伊犁等地的部分样品，并与等级无明显相关。甘草苷不合格的样品产地也主要集中在新疆，尤其以新疆29 团、30 团、轮南、精河、伊犁等地不合格比较严重。

诸多产地中甘肃榆中的一等甘草质量最佳，其甘草酸质量分数最高达4.68%、甘草苷质量分数最高达5.14%，在测定的成分中22-β-乙酰氧基-甘草酸、甘草苷元-7,4'-二葡萄糖苷均为峰值，且甘草皂苷G2质量分数为0.456 0%，仅次于内蒙古乌拉特前旗GC07-01样品（0.468 1%），见表4。

表4 甘草中甘草酸及甘草苷类化合物质量分数 %

续表4

3.3 甘草酸及甘草苷类化合物与甘草粉末粒度的相关性

由表5可知，甘草粒度分布与有效成分的含量具有显著相关性。在甘草粒径分布在50.00～100.00、100.00～200.00、200.00～250.00 μm，粒子分布数越多，甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、甘草苷元-7,4'-二葡萄糖苷、维采宁和异甘草苷的含量越低，且在100.00～200.00 μm，粒子分布越多，22-β-乙酰氧基-甘草酸的含量越高；但是在500.00～1000.00 μm，粒子分布越多，甘草苷及异甘草苷的含量越高；在1000.00～2000.00 μm，粒子分布越多，甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、维采宁和异甘草苷的含量均越高，仅22-β-乙酰氧基-甘草酸的含量越低。

提示甘草酸、甘草皂苷G2、甘草苷、甘草苷元-7,4'-二葡萄糖苷、维采宁和异甘草苷含量与50.00～250.00 μm 的粒子分布呈负相关，而与1000.00～2000.00 μm 分布的粒子呈正相关；甘草苷及异甘草苷的含量与500.00～1000.00 μm 分布的粒子呈正相关。根据3.1 项下结果，40份甘草粉末样品的粒径分布 在2.00～20.00、20.00～50.00、50.00～100.00、100.00～200.00、250.00～500.00、500.00～1000.00 μm几个区段内的粒子分布体积占比较大（均值＞10%），由此可推测，甘草粉末粒径在50.00～200.00、500.00～1000.00 μm 分布，与甘草质量直接相关。50.00～200.00 μm 分布越少，500.00～1000.00 μm分布越多，同时在更高的粒径范围内分布越多，甘草质量可能越好。

4 讨论

本研究以甘草为研究对象引入粒度分析仪，分析了甘草粉末的粒度分布，测量结果准确、可靠，适用于将中药材粉体特征鉴别指标客观化、量化。通过分析甘草粉末粒度分布与有效成分含量之间的相关性，发现甘草粉末粒度分布与有效成分的含量具有显著相关性，将粒度分布同中药材品质相关联，提供客观的数据支持，为现代中药鉴定数字化发展提供了新方法、新思路。

本研究统计甘草粉末样品粒度分布体积占比大于10% 的区段，推测甘草粉末粒径在50.00～200.00 μm 和500.00～1000.00 μm 的分布可用于表征甘草粉体特性，与甘草质量直接相关。相关性分析表明，甘草粉末粒径在50.00～250.00 μm分布越少，500.00～1000.00 μm 及更高的粒径范围内分布越多，甘草质量可能越好。《中国药典》2020年版（一部）规定粗粉指能全部通过二号筛[（850±29）μm]，但混有能通过四号筛[（250±9.9）μm]不超过40%的粉末；中粉是指能全部通过四号筛[（250±9.9）μm]，但混有能通过五号筛[（180±7.6）μm]不超过60%的粉末[1]。因此本研究结果表明，甘草粉末（粗粉）中满足中粉要求（能通过四号筛）的体积占比越大，甘草酸和甘草苷等活性成分含量越低。

自古以来甘草以粉性为佳，但“粉性”科学内涵仍有待发掘，量化评价方法仍有待建立。本研究除了将粒度分布同甘草品质相关联外，采用的技术和方法还可为“粉性”的量化提供参考，对揭示中药辨状论质方法学的本质有一定意义。