淡豆豉关键质量指标的确定及标准修订△

李宁新，卢志标，马潇，李明华，郭晓晗，程显隆*，魏锋*，马双成

1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.桂林三金药业有限公司，广西 桂林 541000；3.甘肃省药品检验研究院，甘肃 兰州 730000

淡豆豉为《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2015年版收载品种，其为豆科植物大豆Glycinemax(L.) Merr.的成熟种子的发酵加工品,具有解表、除烦、宣发郁热的功效，临床用于感冒、寒热头痛、烦躁胸闷、虚烦不眠[1]。研究表明，淡豆豉中的主要成分有大豆蛋白、异黄酮类等[2-7]。

目前存在以黑芸豆冒充淡豆豉、发酵不完全的质量问题，除《中国药典》外，全国共有22个省市中药饮片炮制规范收载了淡豆豉饮片，这些质量标准不能控制上述质量问题。《中国药典》(2015年版)存在的问题一是来源中没有明确是黑豆还是黄豆；二是性状项下内容不完善，没有淡豆豉区别于黑芸豆、料豆等其他豆类的性状特征描述；三是缺少专属性的质量控制指标，薄层色谱鉴别专属性不强，不能有效地区分黑芸豆和淡豆豉；四是标准中无法对淡豆豉是否发酵进行界定。鉴于标准存在的上述问题，对淡豆豉质量标准的来源、性状、鉴别进行了修订，并增加了含量测定项，有效地控制淡豆豉质量。

1 材料

1.1 仪器

Waters 2695 高效液相色谱仪、Empower 色谱工作站；AE 204 型梅特勒-托利多万分之一电子天平；超纯水仪(Millipore 公司)；KQ5200DE 型超声波清洗仪(江苏省金坛市宏凯仪器厂)。

1.2 试药

染料木素、大豆异黄酮对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为111704-201703、111502-200402，纯度均为99.9%)；黄曲霉素混合对照品溶液(中国食品药品检定研究院，批号：610001-201905)；冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号：10000218)；乙腈(Fisher Chemical，色谱纯，批号：178509)；水为自制超纯水。

淡豆豉为按批准文号生产的中药饮片。本次实验研究收集了国内20多家，25批次淡豆豉产品，包括各大型企业，样品具有广泛的代表性。同时收集了10批黑芸豆发酵品，见表1。

表1 淡豆豉及黑芸豆发酵品信息

2 方法与结果

2.1 来源

本品为黑豆的发酵加工品。

2.2 性状

本品呈椭圆形，略扁，长0.6～1 cm，直径0.5～0.7 cm，表面黑色，皱缩不平，一侧有长椭圆形种脐，质地稍疏松，柔软或脆。断面棕黑色。气香，味微甘。淡豆豉种脐典型特征见图1A。伪品黑芸豆发酵品的典型特征是种脐呈近圆形或椭圆形，约占总长的1/6，见图1B。

注：A.淡豆豉；B. 黑芸豆发酵品。图1 淡豆豉与黑芸豆发酵品典型特征

2.3 薄层鉴别

取本品粉末(过二号筛)约1 g，加乙醇25 mL，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取淡豆豉对照药材1 g，青蒿对照药材0.2 g，同法分别制成对照药材溶液。再取大豆苷元和染料木素对照品，分别加乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述5种溶液5～10 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸(10∶4∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视，供试品色谱中，在与青蒿对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的蓝色荧光主斑点；再置紫外光灯(254 nm)下检视，供试品色谱中，在与淡豆豉对照药材和大豆苷元、染料木素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。淡豆豉及其伪品黑芸豆发酵品代表色谱图见图2。

注：A. 紫外光(365 nm)下检视；B. 紫外光(254 nm)下检视；1.大豆苷元；2.染料木素；3.青蒿对照药材(批号：121016～201506)；4.淡豆豉对照药材(批号：121594～201804)；5.淡豆豉样品13；6.淡豆豉样品14；7.黑芸豆发酵品1；8.黑芸豆发酵品2。图2 淡豆豉及其伪品黑芸豆发酵品薄层色谱图

2.4 黄曲霉毒素

2.4.1色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲醇(35∶10)为流动相A，以水流动相B；采用光化学衍生器(254 nm)，以荧光检测器检测，激发波长为360 nm，发射波长为450 nm，2个相邻色谱峰的分离度应>1.5。

2.4.2对照品储备液配制 取黄曲霉毒素混合对照品溶液(黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的质量浓度分别为1.02、0.43、1.06、0.38 μg·mL-1)1 mL稀释至10 mL备用。色谱图见图3。

注：A.混合对照品；B.检出限；C.样品。图3 黄曲霉素测定HPLC图

2.4.3标准曲线配制 取对照品储备液分别稀释5、10、20、50、100、200倍即得。以质量浓度X为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2回归方程分别为：Y=41.177X+10.182(r=0.996 5)；Y=93.94X+6.872 7(r=0.996 5)；Y=19.089 0X+3.914 8(r=0.996 4)；Y=48.545X+4.149 2(r=0.996 6)。

2.4.4供试品溶液的制备 取供试品粉末约15 g(过二号筛)，精密称定，置均质瓶中，加氯化钠3 g，精密加入70%的甲醇75 mL，高速搅拌2 min(搅拌速度>11 000 r·min-1)，2500 r·min-1(离心半径为15 cm)离心5 min，精密量取上清液15 mL，置50 mL的量瓶中，1%的聚山梨酯20稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(玻璃纤维滤纸)滤过，取续滤液20 mL，过免疫亲和柱，流速3 mL·min-1，用1%聚山梨酯20 10 mL洗脱，再用10 mL水洗脱，弃去洗脱液，使空气进入柱子，将水吹干，用适量甲醇洗脱，收集洗脱液至2 mL量瓶中，并用甲醇定容，摇匀，即得。色谱图见图3。

2.4.5样品测定 按2.4.1、2.4.2、2.4.3项下对照品与供试品溶液制备方法，制得对照品和供试品溶液。分别精密吸取对照品和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定即得。22批淡豆豉样品结果显示，有11批样品检出黄曲霉毒素B1，结果均小于1 μg·kg-1，黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2均未检出。其余11批样品中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2均未检出。

2.5 含量测定

2.5.1色谱条件与系统适用性试验 以Agilent SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱为固定相；以乙腈-1%冰醋酸(25∶75)为流动相；流速为1 mL·min-1；柱温为40 ℃；检测波长为260 nm。理论板数按大豆苷元、染料木素峰计算均不得低于5000。

2.5.2对照品溶液的制备 取大豆苷元对照品、染料木素对照品各10 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得(每1 mL中含大豆苷元21.14 μg，染料木素各18.01 μg)。见图4。

2.5.3供试品溶液的制备 取本品粉末(过四号筛)约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流1 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得(见图4)。

注：A.对照品；B.样品；1.大豆苷元；2.染料木素。图4 淡豆豉含量测定对照品及样品HPLC图

2.5.4线性关系考察 取大豆苷元和染料木素对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1 mL含大豆苷元21.14 μg、染料木素18.01 μg的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液各1、2、5、10、15、20、25、30 μL，按拟定色谱条件测定峰面积。以进样量X(μg)为横坐标，色谱峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。大豆苷元的回归方程为Y=5 000 000X-1 182.3，线性范围为0.021 14～0.634 2 μg，r=1；染料木素的回归方程为Y=8 000 000X-4 376.3，线性范围为0.018 0～0.540 3 μg，r=0.999 9。

2.5.5精密度试验 分别精密吸取同一对照品溶液10 μL，按照2.5.1项色谱条件进行测定，连续进样6次，结果6次进样所测得色谱峰的峰面积RSD均小于1.0%，表明精密度良好。

2.5.6稳定性试验 分别精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别在0、4、8、12、24、48 h按照2.5.1项色谱条件进行测定，结果6次进样所测得色谱峰的峰面积RSD均小于1.0%，表明24 h内供试品溶液稳定性较好。

2.5.7重复性试验 分别精密称取同一批样品(样品16)6份，按2.5.3项下方法制备供试品溶液，进行含量测定，结果大豆苷元平均质量分数为0.070 6%，RSD为0.61%，染料木素平均质量分数为0.031 1%，RSD为0.72%，表明重复性良好。

2.5.8加样回收率试验 取重复性试验已测知含量(大豆苷元0.705 7 mg·g-1、染料木素0.310 7 mg·g-1)的药材(样品16)粉末0.50 g，精密称定，精密加入大豆苷元、染料木素混合对照品溶液(大豆苷元15.8 μg·mL-1、染料木素6.4 μg·m L-1)25 mL，按照拟定的方法制备供试品溶液，平行制备6份，按拟定的色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果大豆苷元加样回收率为102.15%，RSD为0.92%；染料木素加样回收率为100.22%，RSD为1.27%，结果见表2。表明方法的准确度良好。

表2 淡豆豉大豆苷元、染料木素加样回收率结果(n=6)

2.5.9样品测定 按2.5.2和2.5.3项下供试品与对照品溶液制备方法，制得供试品和对照品溶液。精密吸取大豆苷元、染料木素混合对照品溶液(大豆苷元21.14 μg·mL-1、染料木素18.01 μg·mL-1)10 μL，供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算含量。结果(按干燥品计算)见表3。

根据测定结果，20批淡豆豉大豆苷元质量分数为0.020 7%～0.107 8%，染料木素质量分数为0.007 2%～0.077 3%，大豆苷元和染料木素含量总和为0.038 4%～0.175 0%，含量总和平均值为0.088%。由于含量范围变化幅度较大，根据样品发酵实际情况，将限度设定为0.040%。

3 讨论

淡豆豉的基原规定了本品为豆科植物大豆G.max(L.)Merr.的成熟种子的发酵加工品。大豆有黄豆、黑豆两大类。经本草考证，唐代《日华子本草》、明代《雷公药性赋》《本草逢原》《神农本草经疏》中认为“豆惟黑者入药”；宋代苏颂的《本草图经》中记载“大豆有黑白二种，黑者入药，白者不用”。明代李时珍也认为应以黑豆入药。并且在一些地方炮制规范中，均明确以黑豆为原料生产淡豆豉。《中国药典》(2015年版)淡豆豉标准中没有明确规定到底用哪种大豆，但性状描述为表面黑色，为黑豆发酵品的颜色。因此，建议标准中基原应明确为黑豆。鉴于黑豆药材已被收载于《中国药典》(2015年版)，建议来源描述为：本品为黑豆的发酵加工品。

目前，淡豆豉的主要质量问题是以黑芸豆冒充黑豆投料。经过比对，发现淡豆豉和黑芸豆可以从种脐的性状进行区分，但这个特征没有在标准中体现出来。现将淡豆豉与发酵黑芸豆的来源、性状区别比较：黑豆为豆科大豆属，属于大豆类，富含蛋白质，种脐长椭圆形，约占总长的1/3，胚芽未发育成真叶；黑芸豆为豆科菜豆属，属于淀粉豆类，富含淀粉，豆仁白色，种脐近圆形或椭圆形，约占总长的1/6，胚芽已发育为真叶的雏形。鉴于种脐特征最明显，在实际检验检测中容易判断。因此，建议把种脐特征写入标准中。

按《中国药典》(2015年版)一部淡豆豉项下薄层鉴别方法进行试验，在硅胶G板上展开，紫外光(365 nm)下检视，淡豆豉和黑芸豆发酵品均与淡豆豉和青蒿对照药材相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。说明该薄层方法专属性不强，无法区分正伪品。并且试验发现，淡豆豉中的染料木素和大豆苷元在紫外光(365 nm)下不显示斑点，说明在紫外光(365 nm)下检视的不是大豆异黄酮类成分。将染料木素和大豆苷元在GF254硅胶板上展开，置于紫外光(254 nm)下，则显示出荧光淬灭斑点。因此，通过改变薄层板和优化开剂比例，增加染料木素和大豆苷元为对照品，提高薄层鉴别方法的专属性。将展开剂由甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)改为甲苯-甲酸乙酯-甲酸(10∶4∶0.5)，薄层板由硅胶G板改为硅胶GF254，在紫外光(254 nm)下检视，淡豆豉在与染料木素和大豆苷元对照品、淡豆豉对照药材相应的位置上，显相同颜色的荧光淬灭斑点，伪品黑芸豆发酵品在与染料木素和大豆苷元对照品、淡豆豉对照药材相应的位置上，未显相同颜色的荧光淬灭斑点。试验结果显示，25批正品淡豆豉薄层斑点清晰可见，而10批伪品均未出现相应的薄层斑点，说明更改后的淡豆豉薄层方法专属性强，可用于鉴别正伪品。

鉴于淡豆豉在发酵的过程中，需要微生物参与。为了考察淡豆豉是否引入黄曲霉，进行了黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2测定。在测定的22批淡豆豉样品中，只有11批样品检出黄曲霉毒素B1，并且结果均小于1 μg·kg-1，低于《中国药典》(2015年版)中5 μg·kg-1的限度。鉴于上述情况，建议暂不将黄曲霉毒素的检测纳入《中国药典》。

已有文献报道淡豆豉中异黄酮类成分的含量测定方法[8-10]，其中包括对淡豆豉中大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、黄豆苷元、黄豆黄素、染料木素6种异黄酮类成分的测定。鉴于药品质量标准的建立，应以最低的检测成本，达到最有效质量控制的目的为原则。实验考察发酵前后黑豆中6种异黄酮类的含量变化，结果显示，发酵前的黑豆中结合型异黄酮大豆苷、染料木苷、黄豆黄苷的含量较高，游离型大豆苷元、染料木素、黄豆黄素的含量很低；发酵后，淡豆豉中结合型异黄酮大豆苷、染料木苷、黄豆黄苷的含量明显降低，游离型异黄酮大豆苷元、染料木素、黄豆黄素的含量明显增高。结合型异黄酮与游离型异黄酮成负相关。并且，3种游离型异黄酮成正相关，因此只对含量较高的2个异黄酮类成分大豆苷元、染料木素进行测定，就可以反映淡豆豉中的异黄酮类成分。实验还对黑芸豆发酵样品进行分析，发现10批黑芸豆发酵品仅4批次检出极微量的大豆苷元峰，其余黑芸豆发酵品中几乎不含大豆苷元、染料木素。因此，选定的含量测定指标大豆苷元、染料木素能够有效地鉴别伪品，有效地控制淡豆豉的质量。