淫羊藿药材及饮片质量分析与标准制定△

王常顺，段吉平，康帅，袁浩，刘永利*，冯丽*

1.河北省药品检验研究院/国家药品监督管理局中药材质量监测评价重点实验室，河北 石家庄 050227；2.中国食品药品检定研究院，北京 100050

淫羊藿为常用中药材，始载于《神农本草经》[1]，以后历代本草多有收录，《中国人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)自1963年版开始收载，来源、药用部位等几经变化，见表1。2015年版收载了淫羊藿(以下称心叶淫羊藿)、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿、朝鲜淫羊藿4个来源。饮片有2种，一种切丝(以下称淫羊藿丝)，一种加羊油炒(以下称炙淫羊藿)。现行质量标准药材与淫羊藿丝用紫外-可见分光光度法测定总黄酮和HPLC测定淫羊藿苷含量，炙淫羊藿的含量测定增加了宝藿苷Ⅰ，其他基本与药材相同[2]。

近些年，对朝鲜淫羊藿中淫羊藿苷含量不合格情况反映较多，甚至有经营者为了符合《中国药典》要求而采用加热等技术手段提高淫羊藿苷含量[3-7]，严重影响了药材与饮片质量。为此，笔者从2013年开始，从中药材专业市场、饮片生产企业、

表1 历版《中国药典》淫羊藿来源与药用部位、炮制方法变化

饮片经营使用单位、种植基地、产地等陆续收集了104批样品，研究建立了一标多测的含量测定方法，将测定淫羊藿苷单个成分修订为同时测定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C与淫羊藿苷4个成分，通过对药材与饮片的含量进行统计分析制定限度，使质量标准能更加科学合理，实现了从整体上控制药材质量，也防止了种植者、经营者为提高《中国药典》中的某个指标成分而采取所谓的“技术手段”。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪：Agilent 1260(美国安捷伦公司，四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器)；电子天平：Mettler XPE26(瑞士Mettler公司，0.001 mg)，Mettler XS105DU(瑞士Mettler公司，0.01 mg)；超纯水仪(美国Millipore公司)。

1.2 试药

朝藿定A对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：110623-72-8，以100.0%计)；朝藿定B对照品(上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：110623-73-9，以100.0%计)；朝藿定C(中国食品药品检定研究院，批号：111780-200801，以99.1%计)；淫羊藿苷(中国食品药品检定研究院，批号：110737-201516，以94.2%计)；宝藿苷Ⅰ(中国食品药品检定研究院，批号：111852-201603，以99.9%计)；甲醇、乙腈为色谱纯(德国Merk公司)；乙醇为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱(0～30 min，24%～26%A，30～31 min，26%～45%A，31～45 min，45%～47%A)；检测波长：270 nm；流速：1 mL·min-1；进样量：10 μL。4种基原药材色谱见图1。

注：A.混合对照品；B.心叶淫羊藿；C.朝鲜淫羊藿；D.柔毛淫羊藿；E.箭叶淫羊藿；1.朝藿定A；2.朝藿定B；3.朝藿定C；4.淫羊藿苷；5.宝藿苷Ⅰ。图1 淫羊藿对照品及样品HPLC图

2.2 对照品溶液制备

取淫羊藿苷对照品5.125 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，再精密量取10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。

2.3 供试品溶液制备

取本品叶片粉末(过三号筛)约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，称定质量，超声处理(功率：400 W，频率：50 kHz)1 h，再称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察

分别称取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷I对照品5.094、5.187、5.489、5.372、3.310 mg，加甲醇配成系列浓度溶液，进样测定，记录峰面积。以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量为横坐标绘制标准曲线，5种成分线性关系良好，见表2。

2.5 重复性试验

取心叶淫羊藿粉末，混匀，称取粉末0.1、0.2、0.3 g各3份，精密称定，按2.3项下方法制成供试品溶液，按2.1色谱条件测定，结果朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷I质量分数分别为1.65、3.81、6.33、7.29、1.49 mg·g-1，RSD分别为1.2%、0.8%、1.6%、1.1%、1.2%，表明本方法的重复性良好。

2.6 回收率试验

取已知含量的心叶淫羊藿粉末，每份约0.1 g，精密称定，分别加入高、中、低浓度的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷I混合对照品溶液20 mL，再按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1色谱条件测定，计算回收率。结果见表2。表明本方法回收率良好。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0、1、2、5、12、15、24 h进样测定，记录峰面积积分值，结果朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷I峰面积积分值RSD分别为1.2%、1.3%、1.2%、1.2%、1.3%。表明供试品溶液在室温下放置，至少24 h内稳定。

3 一标多测研究

淫羊藿苷与朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C等均为黄酮醇苷类化合物，母核结构相同，见图2。为简化实验，以淫羊藿苷对照品为参照进行了一标多测研究，对校正因子进行了测定与耐用性考察。

图2 淫羊藿苷与朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C分子结构

3.1 色谱条件

色谱条件同2.1。

3.2 相对保留时间和校正因子(f)的测定

分别精密称取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷对照品各3份，加甲醇配制成系列浓度溶液，注入液相色谱仪，测定峰面积，绘制标准曲线(r均为0.999 9)，见表3。采用标准曲线法计算校正因子f，结果朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的校正因子分别为1.35、1.28、1.22，RSD分别0.8%、0.9%、1.2%；相对保留时间分别为0.73、0.81、0.90，RSD分别为0.4%、0.1%、0.4%。

f=ks/ki

(1)

ks表示参照物标准曲线斜率。ki表示待测成分标准曲线斜率。

3.3 外标法测定含量与校正因子一标多测法测定含量对比

将外标法计算的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷与一标多测法计算结果进行了对比，结果RSD均小于3%，统计分析差异无统计学意义，表明外标法与一标多测法测定结果一致。

4 含量限度制定

104批淫羊藿药材与饮片含量测定结果见表4。因市场上基本没有箭叶淫羊藿，收集到的5批箭叶淫羊藿样品均来自贵州雷山栽培基地，不具代表性，因此不做分析。

表3 一标多测校正因子测定各成分标准曲线测定数据

表4 淫羊藿药材与饮片含量测定结果 %

续表4

续表4

续表4

从总黄酮醇苷含量箱式图(见图3)可以看出，淫羊藿药材与淫羊藿丝含量基本相同，而炙淫羊藿含量较低，而且淫羊藿丝炮制方法为简单切制，因此将药材与淫羊藿丝一起统计分析，制定限度。

图3 淫羊藿药材、淫羊藿丝、炙淫羊藿总黄酮醇苷含量箱式图

朝鲜淫羊藿4个成分总和为0.5%～2.5%，其他3种淫羊藿为1.5%～13.2%，炙朝鲜淫羊藿4个成分总和为0.4%～1.8%，其他3种炙淫羊藿为0.9%～2.6%。从各成分含量统计图(图4～6)可以看出，朝鲜淫羊藿含量与其他种差异明显。方差分析结果表明，朝鲜淫羊藿与其他基原差异有统计学意义(P<0.01)。

图4 淫羊藿药材及淫羊藿丝含量分布箱式图

图5 淫羊藿药材及淫羊藿丝含量分布面积图

图6 炙淫羊藿含量分布箱式图

将含量测定数据输入SPSS 22.0 软件，对样品进行聚类分析，采用组间连接法，以欧式平方距离为分类依据，结果见图7～8，由药材和淫羊藿丝聚类结果可见，朝鲜淫羊藿基本聚为一类，心叶淫羊藿有17批聚为一类，另外批次与柔毛淫羊藿聚为一类，表明总黄酮醇苷含量主要与基原有关，与产地、采收时间等可能也有一定联系。由炙淫羊藿聚类结果可见，炙朝鲜淫羊藿聚为一类，炙心叶淫羊藿聚为一类。

图7 淫羊藿药材及淫羊藿丝含量测定结果聚类分析

图8 炙淫羊藿含量测定结果聚类分析

目前市场上主要以心叶淫羊藿与朝鲜淫羊藿为主，柔毛淫羊藿与箭叶淫羊藿较少见，而朝鲜淫羊藿中各成分含量与其他种淫羊藿有显著性差异，因此建议将朝鲜淫羊藿限度单列。根据样品测定数据，药材与淫羊藿丝限度为：朝鲜淫羊藿含朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷总量不得低于0.50%。淫羊藿、柔毛淫羊藿、箭叶淫羊藿不得低于1.5%。炙淫羊藿限度为：朝鲜淫羊藿含朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷总量不得低于0.40%。其余3个来源不得低于1.2%；4个来源的宝藿苷I均不得低于0.030%。据此限度，104批样品中只有1批炙淫羊藿总黄酮醇苷(柔毛，YYH004)为0.9%，不符合规定，其余103批均符合规定，合格率为99.0%。

5 讨论

5.1 炮制方法

淫羊藿为复叶，叶柄较多，根据文献报道[8-10]及实测结果，叶柄含量低于叶片，《雷公炮炙论》记载“须用夹刀夹去叶四畔花栨”，即药用实际上是叶片，因此炮制方法建议恢复2010年版《中国药典》以前描述，“摘取叶片，除去杂质……切丝”，即药材带叶柄，炮制时只取叶片，与本草及用药习惯相符。

5.2 关于含量测定取样部位

药材在测定时若不规定摘取叶片，则每次取样时含叶柄的多少将使测定结果相差较大，致使同一批样品测定结果重复性差。另外，淫羊藿炮制时规定摘取叶片，即实际应用的是叶片，因此药材测定也摘取叶片测定，就与饮片规定一致，同一批药材与饮片的含量易于追溯。

5.3 含量测定方法考察

对提取方式、提取时间等进行了考察优化，对不同色谱柱、仪器、柱温、流速等耐用性等进行了考察；一标多测考察了5台仪器、5根色谱柱及柱温、流速、波长等因素对相对保留时间和校正因子的影响，结果RSD均小于2%，表明方法耐用性良好；综合标准复核单位浙江省食品药品检验研究院、成都市食品药品检验研究院结果，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的校正因子分别为1.35、1.28、1.22，相对保留时间分别为0.73、0.81、0.90。

5.4 朝鲜淫羊藿色谱分离度问题

朝鲜淫羊藿色谱中淫羊藿苷分离度差原因分析可能为淫羊藿药材中含有的1种淫羊藿苷的前体化合物3-羰基-2″-β-L-喹诺糖基淫羊藿苷(3-carbonyl-2″-β-L-quinovosyl-icariin)，在分析淫羊藿苷类成分的色谱条件下，表现为前伸峰，峰高较低，其他3个基原含量较高，难以察觉[11-12]。

5.5 限度制定

根据统计分析，朝鲜淫羊藿与其他3个基原在淫羊藿苷等4种成分差异有统计学意义，因此将朝鲜淫羊藿限度单列。柔毛淫羊藿、箭叶淫羊藿目前市场极少见，样品代表性差，今后将继续收集样品，积累数据，制定更加科学严谨的质量标准。

5.6 薄层鉴别

现行质量标准还收载了以淫羊藿苷对照品的薄层色谱鉴别，但背景较重，斑点分离度差。本研究尝试对方法进行了优化，但是不同基原的淫羊藿药材主斑点个数、斑点大小、颜色等差异较大，难以建立统一的方法，今后将继续进行研究。

5.7 其他项目测定

对所有药材与饮片均测定了总黄酮、浸出物、水分、总灰分等项目，结果均符合《中国药典》2015年版要求，表明现行标准限度合理。