水提取法和仿生提取法研究菲牛蛭不同炮制品的体外抗凝活性△

钟苗，雷艳，谭赫，王雄飞，侯觉文，谢海林，单宇，袁瑞娟*

1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；2.广西复鑫益生物科技有限公司，广西 南宁 530000；3.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193

水蛭别名蚂蟥，是我国传统的动物类药材，具有破血通经、逐瘀消癥等功效。药理学研究表明，水蛭具有抗凝血、溶血栓、抗肿瘤、抑制肿瘤细胞凋亡等作用，其中抗凝作用为其主要药理作用。我国水蛭的品种有上百种，2015年版《中华人民共和国药典》(一部)收录了蚂蟥(宽体金线蛭)、水蛭和柳叶蚂蟥3种，其中临床应用较多的品种是宽体金线蛭[1]。广西、云南的地方标准中收录了菲牛蛭，研究发现其抗凝血活性远高于宽体金线蛭[2]。为达到矫臭祛味、易于粉碎、缓性减毒的目的，水蛭常经过炮制后入药，炮制方法多为滑石粉烫制、酒炙。但现代研究表明，水蛭的活性成分为蛋白多肽类，如水蛭素、菲牛蛭素等[3-6]，高温炮制使水蛭蛋白类有效成分空间结构改变，变性失活。大量的研究数据表明，经炮制后，水蛭的水溶性蛋白大幅度降低，而且炮制温度越高，药效损失越大[7-11]。但这些研究通常采用水提取法，而水蛭通常以口服形式给药，在胃肠道消化酶作用下，蛋白质多肽类成分易被降解失活，因此在体内发挥抗凝溶栓药效的成分与水提取出的成分未必一致。本课题组曾采用水提取法和仿生提取法分别研究宽体金线蛭不同炮制品的体外抗凝活性，结果表明采用水提取法时，炮制后抗凝活性降低；而采用仿生提取法时，炮制后抗凝活性反而升高，由于仿生提取法与人体的吸收过程更为接近，因此笔者认为炮制有其科学性[12]。对于抗凝活性更高的菲牛蛭，目前对于其炮制前后抗凝活性变化的研究较少。因此本课题组利用仿生酶解及水提取的方法提取菲牛蛭及其炮制品的活性成分，测定多个凝血指标的变化，科学评价不同炮制方式对菲牛蛭抗凝活性的影响。

1 材料

1.1 仪器

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(北京世纪予华仪器有限公司)；METTLER TOLEDO 实验室pH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；LG-PABER-I半自动凝血分析仪(北京世帝科学仪器公司)；UH5300双光束紫外-分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.2 试药

菲牛蛭(Poecilobdella manillensis)活体，由广西复鑫益集团有限公司提供，冷冻干燥或吊干后使用，经北京中医药大学中药学院中药鉴定系杨瑶珺教授鉴定为菲牛蛭；滑石粉(北京市双桥燕京中药饮片厂，批号：1608009)；黄酒(五年陈酿·清爽型黄酒，湖州老恒河酿造有限公司)；胃蛋白酶(1∶10 000，北京拜尔迪生物技术有限公司，批号：9001756)；胰蛋白酶(1∶250，北京拜尔迪生物技术有限公司，批号：9002077)；活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)试剂盒(上海太阳生物技术有限公司)；福林酚试剂(F8060，北京索莱宝科技有限公司)；比伐卢定(上海源叶生物科技有限公司)；浓盐酸、氢氧化钠、碳酸钠、硫酸铜、酒石酸钾、95%乙醇、85%磷酸等为分析纯；实验用水为娃哈哈纯净水。

雄性健康大耳白兔，质量2 kg，动物许可证号为SCXK(京)2017-0005，符合国家健康一级动物标准。

2 方法

2.1 菲牛蛭的炮制

2.1.1 活体冻干品 菲牛蛭冷冻干燥后，粉碎，过三号筛，-20 ℃密封保存，备用。

2.1.2 清水吊干品净制 取菲牛蛭活体，清水洗净表面附着物，置于阳光下暴晒至干后，粉碎，过三号筛，-20 ℃密封保存，备用。

2.1.3 滑石粉烫制 参照文献[12]进行。

2.1.4 酒浸闷烘 参照文献[12]进行。

2.2 菲牛蛭活性成分的提取

2.2.1 仿生提取法 参照文献[12]，修改后进行。取9 mL浓HCl，加水定容至1000 mL，制得人工胃液。取10 mL人工胃液加入适量胃蛋白酶(酶底比1.25%)并搅拌均匀，分别加入菲牛蛭各样品粗粉0.40 g(测定抗凝血酶活性时，取15 mL人工胃液加入各样品粗粉0.50 g，其余操作同)，置37 ℃恒温磁力搅拌器中搅拌3 h；用浓度为1 mol·L-1的NaOH溶液将溶液pH调至6.80(胰蛋白酶生理条件，加入NaOH的体积对溶液浓度的影响可忽略不计)，再加入适量胰蛋白酶(酶底比7.5%)，搅拌均匀，37 ℃条件下磁力搅拌2 h；取出样品，85 ℃水浴灭活15 min，冷却至室温；15 000 r·min-1离心20 min(离心半径为10 cm)，取上清液用空白酶解液(除不加水蛭粗粉外，其余操作相同)稀释9倍后，备用。

2.2.2 水提取法 取4个样品粗粉各0.40 g加至10 mL去离子水中(测定抗凝血酶活性时，取菲牛蛭及其炮制品粗粉0.50 g加至15 mL去离子水中，其余操作相同)，室温条件下磁力搅拌5 h，15 000 r·min-1(离心半径为10 cm)离心后分取上清液，用去离子水稀释9倍后，备用。

2.3 抗凝活性测定

2.3.1 血浆制备 向健康兔耳缘静脉注射乌拉坦致其麻醉，颈动脉取血至装有质量浓度为3.8%的枸橼酸钠抗凝剂(9∶1)的离心管中，混匀，立即4000 r·min-1离心15 min(离心半径为10 cm)，取得贫血小板血浆(PPP)，备用。

2.3.2 APTT测定 参照试剂盒测试说明进行，将上述PPP、菲牛蛭各样品溶液、APTT试剂加入测试杯中，记录下血浆凝固时的APTT，并记录空白参比的APTT(水提法中以水为空白参比，仿生提取法中以空白酶解液为空白参比)。

2.3.3 PT测定 参照试剂盒测试说明进行，将上述PPP、菲牛蛭各样品溶液、PT试剂加入测试杯中，血浆凝固时记录下其PT，并记录空白参比的PT。

2.3.4 TT测定 参照试剂盒测试说明进行，将上述PPP、菲牛蛭各样品溶液、TT试剂加入测试杯中，血浆凝固时记录下其TT，并记录空白参比的TT。

2.4 蛋白质含量的测定

2.4.1 碱性铜试液的制备 将10 g氢氧化钠、50 g碳酸钠，溶于400 mL水中，作为甲液；另取酒石酸钾0.5 g，溶于50 mL水中，得A液；取硫酸铜0.25 g，溶于30 mL水中，得B液；将A、B液混合作为乙液。临用前，合并甲、乙液，加水定容至500 mL。

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称定比伐卢定2.00 mg，加水定容至10 mL，摇匀，即得质量浓度为0.2 g·L-1的比伐卢定对照品溶液，备用。

2.4.3 标准曲线的制作 参照《中华人民共和国药典》四部通则项下的蛋白质含量测定法第二法中测定法进行，以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度做标准曲线，计算线性回归方程。

2.4.4 菲牛蛭及其炮制品的蛋白含量测定 另精密量取各样品溶液(稀释21倍)1 mL，同法测定吸光度。其中水提取法以水为空白对照，仿生提取法以空白酶解液为空白对照。

2.5 抗凝血酶活性测定

2.5.1 三羟甲基氨基甲烷盐酸 (Tris-HCl) 缓冲液的配制 取0.2 mol·L-1的Tris溶液25 mL与0.1 mol·L-1HCl溶液40 mL，混合摇匀，加水定容至100 mL，将溶液pH调至7.40。

2.5.2 抗凝血酶活性测定 取100 μL稀释4倍的样品上清液置试管中，加入临用新配的含纤维蛋白原0.5%的Tris-HCl缓冲液200 μL，置37 ℃水浴环境中温浸5 min，取出缓慢滴加40 U·mL-1的凝血酶溶液(每min滴加1次，开始时每次滴加5 μL，接近滴定终点时减少每次加入的量，边滴边轻轻摇匀)直至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积并以此计算抗凝血酶活性。

2.6 统计方法

3 结果

3.1 APTT测定

取菲牛蛭及其炮制品水提液及仿生提取液测定APTT，结果见表1。

表1 菲牛蛭及其炮制品水提液和仿生提取液APTT测定结果

注：与空白组相比*P<0.01；与活体冻干品相比#P<0.01；与水提法相比△P<0.01。下同。

APTT反映凝血酶原转变为凝血酶的时间，常作为内源性凝血系统实验的筛选指标。APTT实验结果提示，采用水提法和仿生提取法测定的抗凝活性变化趋势一致，均显示炮制后活性降低，且随着炮制温度越高，活性降低越明显，抗凝活性顺序均为活体冻干品>清水吊干品>酒浸闷烘品>滑石粉烫制品。此外，相较于仿生提取法，水提法表现出更好的抗凝效果。

3.2 PT测定

取菲牛蛭及其炮制品水提液及仿生提取液测定PT，结果见表2。

表2 菲牛蛭及其炮制品水提液及仿生提取液PT测定结果

PT反映在待测血浆中加入组织凝血活酶和钙离子使血浆凝固的时间，常作为外源性凝血系统实验的筛选指标。PT实验结果提示，4个样品均表现出一定的抗凝效果。水提取法中，PT大小顺序为：清水吊干品>活体冻干品>酒浸闷烘品>滑石粉烫制品；仿生提取法中，PT大小顺序为：活体冻干品>清水吊干品>酒浸闷烘品>滑石粉烫制品。无论是水提取法还是仿生提取法，炮制品相比活体冻干品PT均有不同程度缩短，均表示炮制后抗凝活性有所下降。

3.3 TT测定

取菲牛蛭及其炮制品水提液及仿生提取液测定TT，结果见表3。

表3 菲牛蛭及其炮制品水提液及仿生提取液TT测定结果

TT反映血浆中纤维蛋白原在标准化凝血酶作用下转为纤维蛋白的时间，反映共同凝血途径。TT 实验结果提示，与空白组相比，水提法与仿生提取法的不同样品均有一定的抗凝效果。水提取法与仿生提取法的TT大小顺序均为：活体冻干品>清水吊干品>酒浸闷烘品>滑石粉烫制品，这表明高温炮制及清水吊干的过程降低了活体冻干品的抗凝活性。

3.4 蛋白质含量测定

以比伐卢定为对照品，采用Lorry法测定菲牛蛭及其炮制品中蛋白质的含量，测得标准曲线线性回归方程为Y=0.053X+0.030 6(r=0.998 9，n=5)。测定菲牛蛭及其炮制品水提物及仿生提取物中的蛋白质含量(以比伐卢定计)，结果见表4。

表4 菲牛蛭及其炮制品水提物及仿生提取物的蛋白质含量测定结果

从表4结果可以看出，无论水提取法还是仿生提取法，菲牛蛭及其炮制品中蛋白质含量顺序均为：活体冻干品>清水吊干品>酒浸闷烘品>滑石粉烫制品，活体冻干品和清水吊干品蛋白含量较高，滑石粉烫制品蛋白含量相较于其他三者明显较低。说明菲牛蛭炮制的过程会降低菲牛蛭蛋白和多肽的含量。该结果与炮制后抗凝活性降低顺序一致，两者可能有相关性。

3.5 抗凝血酶活性测定

根据凝血酶滴定法测定菲牛蛭及其炮制品的抗凝血酶活性，结果见表5。

表5 菲牛蛭及其炮制品水提物及仿生提取物的抗凝血酶活性测定

抗凝血酶活性结果显示，无论是水提取法还是仿生提取法，各样品的抗凝血酶活性顺序为活体冻干品>清水吊干品>酒浸闷烘品>滑石粉烫制品，这与APTT、PT、TT及蛋白含量顺序一致，进一步说明酒浸闷烘及滑石粉烫制的过程使菲牛蛭抗凝活性降低，纤维蛋白原在凝血酶参与下更容易转变为纤维蛋白而发生凝固。

4 讨论

4.1 炮制目的与实验结果分析

水蛭炮制的目的是矫臭祛味、易于粉碎、缓性减毒。其中滑石粉烫制为《中华人民共和国药典》记载的临床常用的炮制方法，烘干温度约200 ℃，具有净制药材、降低毒性、利于粉碎的作用。酒炙法为北京地区特色炮制工艺，烘干温度约60 ℃，因黄酒中含有的乙醇、糖类成分，能大大地降低水蛭的腥臭味，使质地酥脆，易于粉碎；且酒能活血，增强水蛭破血逐瘀通经的功效，又可引药上行，更好地发挥治疗脑血管疾病方面的作用。在本实验中，经过滑石粉烫制和酒浸闷烘后，均能达到矫臭去味、易于粉碎的目的。

很多动物药具有很强的活性，其活性成分往往也会引起毒性，如斑蝥、蜈蚣等经炮制后，活性成分含量降低，毒性作用也降低，药性趋向缓和。水蛭具有破血逐瘀功效，药性峻猛，适当炮制后可能具有减小毒性的作用。但目前对于水蛭毒性的研究很少，据记载，水蛭有小毒，不慎吸入或可导致蛋白过敏症状[13]。本实验的结果表明，炮制后菲牛蛭的抗凝活性降低，尤其是滑石粉烫制后活性降低更严重。推测原因可能是高温破坏了其中的活性成分，但由于其毒性成分未知，因此炮制是否达到了减小毒性的效果有待深入研究。

4.2 水提取法与仿生提取法的比较

水蛭的活性成分多为蛋白质多肽类物质，口服给药后在胃肠道消化酶的作用下易被降解成小分子活性成分，因此发挥抗凝药效的成分与水直接提取出来的成分可能不同。除PT外，反映内源性凝血途径的 APTT以及反映共同凝血途径的 TT均较仿生提取法高，仿生提取法的抗凝血酶活性整体上也高于水提取法。仿生提取法模拟胃肠道消化环境，此结果表明，菲牛蛭采取口服给药时，活性成分在人体胃肠道会发生降解，从而降低活性。因此从活性角度考虑，菲牛蛭活性成分更适合以注射形式给药。

4.3 炮制对水蛭抗凝活性影响的原因分析

血液凝固过程是由内源性途径(所有参与成分均在血液中)、外源性途径(除血液中成分以外，还需要组织因子参与)和两者共同途径组成。当凝血过程通过外源性和内源性途径发展到因子X被激活时，2种途径合二为一，进入共同途径，凝血酶原活化为凝血酶，最终导致纤维蛋白原生成纤维蛋白，血液凝固。3个途径分别用APTT、PT、TT(或抗凝血酶活性)表示。本实验中，采取APTT、PT、TT和抗凝血酶活性4个指标评价菲牛蛭的抗凝活性，几种指标从不同的角度反映了菲牛蛭活性成分参与的抗凝环节。结果显示，无论水提取法，还是仿生提取法，各评价指标均显示炮制后抗凝活性降低，说明菲牛蛭的抗凝活性成分能够作用于抗凝的各途径。活性降低的原因可能是菲牛蛭发挥抗凝作用的活性成分为菲牛蛭素，是来源于水蛭唾液的1种多肽。将菲牛蛭冷冻干燥的过程可以很好地保护菲牛蛭素不被破坏，从而保持菲牛蛭的药用活性。清水吊干的过程中，样品处于太阳下暴晒，会使一部分活性成分变性，从而降低抗凝活性。而菲牛蛭采用滑石粉烫制的过程，需要高达200 ℃以上的高温条件，在如此剧烈的高温炮制条件下，抗凝活性物质变性更为明显。酒浸闷烘品也会使菲牛蛭的抗凝活性降低，猜测是由于有机溶剂和烘干的共同作用所致。综上，可初步认为菲牛蛭炮制后较炮制前抗凝活性降低，但体外的模拟环境仍不能完全替代体内吸收过程，炮制对体内抗凝活性的影响还有待进一步深入研究。

5 结论

本实验以APTT、PT、TT、抗凝血酶活性、蛋白及多肽含量多个指标综合评价了菲牛蛭活体冻干品、清水吊干品、酒浸闷烘品、滑石粉烫制品的体外抗凝活性。实验结果表明，无论是采用水提取法还是模拟人体胃肠道消化环境的仿生提取法，炮制后的菲牛蛭抗凝活性均有所降低，尤其以滑石粉烫制降低更严重。因此，从抗凝活性角度考虑，建议临床使用时避免高温炮制。