HPLC测定远志碱水解8个成分含量△

赵梦君，李晨晨，甘龙，潘瑞乐

中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193

本研究结合远志化学成分特点，认为有机酸和细叶远志皂苷的含量可以间接反映远志中糖酯类成分和皂苷类成分的含量，故将远志水解后进行分析，建立了远志碱水解8个主要成分的含量测定方法，为远志的质量控制提供了新的思路。

1 材料

1.1 仪器

Waters公司高效液相色谱仪，包括：waters e2695泵、waters 2489 紫外-可见光检测器、empower 2色谱工作站、waters 996光电二极管阵列检测器；JA2103N电子分析天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；JM-A30001电子天平(余姚纪铭称重校验设备有限公司)；KQ250B型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；FW135中草药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；OSB-2100 EYELA油浴锅及N-1100旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；DLSB-5/20低温冷却液循环泵(郑州长城科工贸有限公司)。

1.2 试药

对照品对羟基苯甲酸、对羟基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、对甲氧基肉桂酸、细叶远志皂苷购自成都埃法生物技术有限公司(批号分别为：AF7112017、AF8081707、AF7062102、AF7112632、AF8121702、AF8122101、AF8121802、AF8091003，化学结构式见图1)；甲醇、乙腈色谱纯(美国fisher公司)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；其余试剂均为分析纯。

10批远志来源见表1，除样品8为野生品外，其余均为栽培品，经中国医学科学院药用植物研究所张本刚研究员鉴定为远志科远志PolygalatenuifoliaWilld.。

2 方法与结果

2.1 检测波长的确定

采用Waters公司高效液相色谱仪，包括：waters e2690泵、waters 996光电二极管阵列检测器、empower 2色谱工作站，分别对远志水解产物8个成分在190～400 nm进行全波长扫描，扫描结果见图2。结果显示，对羟基苯甲酸(1)最大吸收波长是256 nm，对羟基肉桂酸(2)最大吸收波长310 nm，芥子酸(3)最大吸收波长是323、238 nm，阿魏酸(4)的最大吸收波长是323 nm，苯甲酸(5)的最大吸收波长是196、230 nm，3，4，5-三甲氧基肉桂酸(6)最大吸收波长是231、304 nm，对甲氧基肉桂酸(7)的最大吸收波长是309 nm，细叶远志皂苷(8)只在210 nm附近有末端吸收。综合考虑8个化合物的吸收特征，本研究选择210 nm作为对羟基苯甲酸、苯甲酸、细叶远志皂苷的检测波长，310 nm作为对羟基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、对甲氧基肉桂酸的检测波长。

图1 远志碱水解8个测定成分的结构式

表1 远志药材产地信息

2.2 色谱条件

YMC-Pack ODS-A(250 mm ×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相乙腈(A)-0.05 %磷酸-水溶液(B)，梯度洗脱(0～6 min，20%～22%A；6～8 min，22%A；8～10 min，22%～25%A；10～14 min，25%～28%A；14～30 min，28%～36%A；30～33 min，36%～38%A)；流速为1 mL·min-1；柱温为30 ℃；检测波长为210和310 nm；进样量为10 μL。

上述色谱条件下8个成分在33 min内与其他共存峰均达到基线分离，色谱图见图3，8个测定成分的理论塔板数均>10 000。

2.3 溶液的配制

2.3.1 对照品溶液 精密称取对照品对羟基苯甲酸、对羟基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、对甲氧基肉桂酸、细叶远志皂苷适量，分别置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到对羟基苯甲酸0.255 g·L-1、对羟基肉桂酸0.520 g·L-1、芥子酸0.490 g·L-1、阿魏酸0.513 g·L-1、苯甲酸0.546 g·L-1、3，4，5-三甲氧基肉桂酸0.520 g·L-1、对甲氧基肉桂酸0.521 g·L-1、细叶远志皂苷0.785 g·L-1的对照品储备液。取各对照品储备液各1 mL混合定容至10 mL，得到混合对照品溶液。

注：1.对羟基苯甲酸；2.对羟基肉桂酸；3.芥子酸；4.阿魏酸；5.苯甲酸；6.3，4，5-三甲氧基肉桂酸；7.对甲氧基肉桂酸；8.细叶远志皂苷。图2 远志碱水解8个测定成分全波长(190～400 nm)紫外光谱扫描图

注：A.对照品溶液；B.供试品溶液。图3 远志碱水解产物在210、310 nm波长的HPLC图

2.3.2 供试品溶液 称取样品粉末(过3号筛)1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，超声处理(功率400 W，频率40 kHz)1 h，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25 mL，置圆底烧瓶中，蒸干，残渣加10%氢氧化钠溶液50 mL加热回流2 h，放冷，用盐酸调节pH为4～5，用水饱和正丁醇提取3次，每次 50 mL，合并正丁醇液，回收正丁醇液至干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 将2.3.1项下混合对照品溶液，用甲醇逐级稀释成1、2、4、8、16、32倍数浓度的溶液，摇匀，分别取10 μL注入高效液相色谱仪，按2.2项下色谱条件进行测定，以测得的峰面积为纵坐标，混合对照品质量浓度(μg·mL-1)为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程和r，见表2。

2.4.2 精密度试验 精密吸取2.3.1项下混合对照品溶液10 μL，按2.2项下色谱条件，重复进样6次，记录对羟基苯甲酸、对羟基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、对甲氧基肉桂酸、细叶远志皂苷8个成分的峰面积并计算RSD，结果8个成分的RSD分别为0.30%、0.40%、0.30%、0.30%、0.20%、0.30%、0.40%、0.30%，表明分析方法和仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一远志样品，按2.3.2项下制备成供试品溶液，在室温下放置后于0、2、4、8、12、24、48、72 h，按2.2项下色谱条件测定对羟基苯甲酸、对羟基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、对甲氧基肉桂酸、细叶远志皂苷的峰面积，8种成分峰面积的RSD分别为0.40%、0.60%、0.40%、0.40%、0.40%、0.50%、0.60%、0.30%，表明供试品溶液在72 h内稳定。

2.4.4 重复性试验 取同一远志样品6份，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件测定对羟基苯甲酸、对羟基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、对甲氧基肉桂酸、细叶远志皂苷的峰面积，计算各单位峰面积，结果8成分的单位峰面积RSD分别为3.36%、2.01%、3.25%、2.06%、2.47%、1.72%、3.71%、4.12%，RSD均小于4.12%，表明本方法的重复性良好。

2.4.5 最低定量限(LOQ)和最低检测限(LOD) 根据《中国药典》中“9101药品质量标准分析方法验证指导原则”，以信噪比10∶1时待测物质的最低浓度或量为定量限，以信噪比为3∶1时待测物质的最低浓度或量为检测限。将2.3.1项下对照品稀释至一定倍数，按2.2项下色谱条件进行测定，最终得出对羟基苯甲酸、对羟基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、对甲氧基肉桂酸、细叶远志皂苷的LOQ分别为：0.032、0.065、0.061、0.064、0.068、0.033、0.033、12.266 μg·mL-1，LOD分别为：0.016、0.033、0.015、0.016、0.034、0.016、0.016、6.132 μg·mL-1。

2.4.6 加样回收率试验 精密称取对照品对羟基苯甲酸、对羟基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、对甲氧基肉桂酸、细叶远志皂苷各适量，得到质量浓度分别为1.848、1.238、0.964、0.934、0.382、1.09、1.964、3.836 g·L-1的对羟基苯甲酸、对羟基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、对甲氧基肉桂酸、细叶远志皂苷溶液。

取6份远志粉末，每份0.3 g，精密称定，分别置于250 mL圆底烧瓶中，精密加入2.4.6项下所配制的对羟基苯甲酸、对羟基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、对甲氧基肉桂酸溶液各1 mL，细叶远志皂苷溶液2 mL，用70%甲醇补足至50 mL，按2.3项下方法制成加标供试品溶液，依2.2项下色谱条件测定，计算各成分的平均加样回收率和RSD，结果见表3。8个测定成分的平均回收率分别为：102.36%、102.50%、94.74%、104.95%、94.84%、101.22%、97.69%、96.24%；RSD分别为：1.62%、1.82%、1.44%、1.09%、2.62%、1.62%、2.75%、2.48%，平均回收率为94.74%～104.95%，RSD在1.09%～2.75%(n=6)，结果表明本法的准确性良好。

表2 远志8个水解产物的线性方程和线性范围(n=6)

表3 远志8个水解产物的加样回收率试验(n=6)

2.5 样品测定

精密称取表1中的10批远志粉末，按2.3.2项下方法制成供试品溶液，依2.2项下色谱条件进行测定，外标一点法计算其含量，对羟基苯甲酸、对羟基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、对甲氧基肉桂酸、细叶远志皂苷质量分数分别为0.02%～0.09%、0.20%～0.41%、0.25%～0.70%、0.18%～0.39%、0.19%～0.40%、0.05%～0.68%、0.28%～0.36%、1.77%～4.07%，结果见表4。

表4 远志8个水解产物含量测定结果(n=3) %

3 讨论

3.1 测定指标的选择

远志皂苷主要为五环三萜型，基本母核为齐墩果烷，苷元有远志皂苷元(presenegenin)、2β-羟基-23-醛基齐墩果酸(polygalagenin)、2β-23-二羟基齐墩果酸(bayogenin)等。苷元的区别在于2位碳取代基不同(羟基或酮基)，23位碳氧化度不同(甲基、醛基、羟甲基、羧基或亚甲基)，双键的数量和位置的差异。远志皂苷元是最主要的类型，其皂苷类型多为3-O苷和28位酯苷。皂苷糖链存在一定的酯化结构，主要取代基有4-甲氧基肉桂酰基、3，4，5-三甲氧基肉桂酰基、乙酰基等[20]。远志寡糖酯成分以蔗糖为共同的母核，寡糖母核通常以1个果糖与2个、3个或4个葡萄糖连接而成。蔗糖酯多以果糖的3位羟基和葡萄糖的6位羟基与各种酰基成酯，寡糖酯则在糖环上的不同部位发生不同程度的酯化。远志糖酯主要取代基有：苯甲酰基、对羟基苯甲酰基、肉桂酰基、对甲氧基肉桂酰基等[21]。

从远志皂苷和糖酯的结构特点和取代基种类可以看出，远志皂苷碱水解的主要产物有：葡萄糖、细叶远志皂苷；远志糖酯碱水解主要产物有：乙酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸、苯丙烯酸等。结合化合物紫外吸收特征和对照品色谱保留时间，笔者从远志碱水解产物中鉴定出了对羟基苯甲酸、对羟基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、对甲氧基肉桂酸、细叶远志皂苷、反式肉桂酸和3，4-二甲氧基肉桂酸10个主要成分，由于反式肉桂酸和3，4-二甲氧基肉桂酸含量较低，本研究选择对羟基苯甲酸、对羟基肉桂酸、芥子酸、阿魏酸、苯甲酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸、对甲氧基肉桂酸、细叶远志皂苷8个成分进行分析。

3.2 碱水解后有机酸和细叶远志皂苷的含量与远志中糖酯和皂苷含量的关系

远志糖酯类成分是远志及远志科其他植物中存在的独特化学成分，随着对远志科植物研究的不断深入，糖酯类成分逐渐引起了人们的关注。该类成分具有脑保护、抗抑郁、抗老年痴呆等作用[22-23]。因此远志糖酯类成分的含量是评价远志质量的重要指标。但《中国药典》仅对3，6′-二芥子酰基蔗糖1个糖酯的含量进行测定。远志糖酯成分非常复杂，单个成分的含量不能完全反应远志糖酯的总含量。本研究测定的碱水解7个有机酸，主要来自糖酯的水解，这些有机酸含量的总和可以间接反映远志糖酯含量情况。由于远志皂苷元是远志皂苷的最主要的苷元，因此，远志皂苷碱水解得到的次级皂苷细叶远志皂苷(tenuifolin)的含量也可间接反映远志皂苷含量。故本研究的测定方法及结果，可以为远志质量控制提供一种新的思路和方法。

3.3 不同产地远志药材碱水解含量结果分析

中药材成分复杂，其质量受不同基原、产地、种植方式、生长年限及采收季节等多种因素的影响。据报道，不同季节采收的远志药材其原型成分3，6′-二芥子酰基蔗糖含量差异较大[24]。本研究利用建立的方法对10批不同来源远志药材碱水解8个成分含量进行测定，结果显示不同样品中各成分含量存在明显差异。其中3，4，5-三甲氧基肉桂酸成分差异最大，0.05%～0.68%，相差13.6倍，原因可能与远志糖酯的水解产物和其他酯类均包含此成分有关。《中国药典》中远志指标成分细叶远志皂苷的质量分数为1.77%～4.07%，最高和最低相差2.3倍。与《中国药典》标准比较，针对细叶远志皂苷这一成分，10批测定样品中有4批不达标，涉及市场购买与产地采收2种来源，这提示我们市场药材质量控制手段还有待提高，远志药材使用应严格注意产地选择。

3.4 其他

关于样品制备，样品制备过程中应注意萃取环节，一定要萃取到样品无色透明，本研究均萃取3次；另外对色谱条件的确定，研究过程中比较了不同色谱柱、不同洗脱梯度、不同流速、不同柱温等多个影响因素，最终确定了正文2.2项下色谱条件。

远志作为常用中药，成分复杂，质量控制难度较大。本研究采用碱水解法，将远志中复杂但又具有较好活性的皂苷类成分和糖酯类成分水解为相对简单的细叶远志皂苷、芥子酸、3，4，5-三甲氧基肉桂酸等简单小分子有机酸，并首次建立高效液相色谱测定包括细叶远志皂苷在内的8个碱水解成分含量的方法。该法简便、快速，具有较高的准确度与精密度，且重复性好，能够有效地测定远志药材中主要水解产物的含量，为远志药材质量控制提供了新思路。