款冬花饮片标准汤剂制备及其指纹图谱研究△

许洪波，杨康，高春晖，毛晶晶， 4，蔡兴航，张娱，许怀礼，张鹭，唐志书*

1.陕西中医药大学/陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西 咸阳 712083；2.西安市中医医院，陕西 西安 710021；3.安康北医大制药股份有限公司，陕西 安康 725000；4.杨凌科森生物制药有限责任公司，陕西 杨凌 712100

款冬花为菊科植物款冬TussliagofarfaraL.的干燥花蕾，始载于《神农本草经》[1-2]。款冬花味辛，性温，归肺经，具有润肺下气，止咳化痰的功效[1]，是临床常用中药。2015版《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)收载含款冬花的制剂有13个，如二母安嗽丸、川贝雪梨膏等。现代药理研究表明，款冬花对呼吸、消化系统有一定作用[3-4]，此外，它还有镇咳祛痰[5]和抗炎[6]等药理作用。国内外研究表明，款冬花的化学成分主要为倍半萜[7-9]、黄酮[10-12]、生物碱[13-14]、皂苷[7]和挥发油[15-16]等，其中倍半萜类成分款冬酮 (tussilagone) 被认为是款冬花的特征成分，加之该化合物还具有抗炎、升压等药理作用[17-18]，其作为指标成分被广泛应用于款冬花的质量评价[18-19]。2015年版《中国药典》即以款冬酮作为款冬花药材和饮片的质量控制指标，并规定其量不得少于0.070%。

目前，随着中药饮片形式的创新发展，破壁饮片、配方颗粒等多种现代中药用药形式不断出现，一定程度上弥补了传统中药饮片携带和服用不便的诸多缺陷。其中，中药配方颗粒以“净、便、小、恵、精、稳”的优势正方兴未艾，但配方颗粒至今仍无统一的质量标准，各厂家产品质量亦良莠不齐，故加强配方颗粒生产过程管控，统一质量标准显得尤为重要[20]。2016年，国家药典委员会发布了《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》 (以下简称《要求》)，提出将标准汤剂作为衡量中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的标准参照物。中药饮片标准汤剂是以中医药理论为指导、参考现代提取方法，经标准化工艺制备而成的单味中药饮片水煎剂，可作为一种标准物质和标准体系，标化新型中药制剂，保证其质量稳定、均一，确保临床用药的准确性和剂量的一致性[21]。与饮片相比，标准汤剂能够体现煎煮工艺的影响；与配方颗粒相比，标准汤剂没有辅料的干扰，更加接近临床上直接服用的汤剂[22]。因此，《要求》中明确规定，中药配方颗粒的所有药学研究均须与标准汤剂进行对比，以保证与标准汤剂质量一致性。

本研究以花类饮片——款冬花为研究对象，进行其标准汤剂研究，以《要求》为指导原则，收集款冬花3个道地产区的15批饮片制备标准汤剂，考察标准汤剂出膏率，并建立其含量测定和指纹图谱分析方法，计算指标成分的转移率，以期为款冬花配方颗粒的制备和质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

岛津LC-20A高效液相色谱仪 (包含CBM-20A控制器、SPD-20A紫外检测器、LC-20AT双泵、CTO-20A柱温箱、LC-solution色谱工作站)；SHZ-D型循环水式真空泵、OLSB-5L/10L低温冷却液循环泵 (巩义市予华仪器有限责任公司)；HT-2109型电磁炉 (美的生活电器制造有限公司)；EYELA N-1100旋转蒸发仪 (东京理化器械株式会社)；KQ-300DE型数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)；Zirbus-Vaco5冷冻干燥机 (德国Zirbus)；CPA2250型电子天平 (赛多利斯，精度：0.01 mg)。

1.2 试药

甲醇、乙腈为色谱纯 (德国默克公司)；实验用水均为纯净水；款冬酮对照品 (中国食品药品检定研究院，批号：111884-201704，纯度：99.1%)；其余试剂均为分析纯。

本研究共收集甘肃、内蒙古、河北3个产地共15批款冬花饮片，每个产地各5批，经陕西中医药大学药学院王薇教授鉴定，同时按照《中国药典》2015版一部款冬花项下薄层鉴别方法进行鉴别。结果表明，本研究所收集的15批款冬花饮片均为菊科植物款冬T.farfaraL.的干燥花蕾。15批样品分别编号为：S1～S15，其中S1～S5的产地为甘肃，S6～S10的产地为内蒙古，S11～S15的产地为河北。

2 方法与结果

2.1 款冬花饮片浸出物测定

按照2015年版《中国药典》中醇溶性浸出物测定法 (通则 2201) 项下的第二法进行测定，测得15批款冬花饮片的浸出物为20.9%～27.4%，平均浸出物为24.5%。结果表明，15批样品均符合《中国药典》关于款冬花饮片浸出物不得少于20.0%的规定。

2.2 款冬花饮片中款冬酮的含量测定

按《中国药典》2015年版一部款冬花饮片项下含量测定方法进行检测[1]，得款冬酮质量分数为0.146%～0.420% (见表1)，由结果可知，15批样品均符合《中国药典》中款冬花含量测定要求 (含款冬酮不得少于0.070%)。

表1 款冬花饮片测定结果 %

2.3 款冬花饮片标准汤剂的制备

取款冬花饮片50 g，加入12倍量水浸泡30 min，煎煮30 min，趁热过滤，药渣再加入10倍量水，煎煮20 min，过滤，合并滤液；减压浓缩至适量，进行冷冻干燥，即得款冬花标准汤剂干燥粉末。

2.4 标准汤剂中款冬酮的含量测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱为Thermo ODS Hypersil(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-水(85∶15)为流动相[1]；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为220 nm；柱温为25 ℃；进样20 μL。在此条件下，供试品溶液中款冬酮分离较好，其他成分无干扰 (见图1)。

2.4.2 对照品溶液制备 精密称定款冬酮对照品11.20 mg，加入流动相制成每1 mL含55.5 μg的溶液，即得。

2.4.3 供试品溶液制备 提取溶剂的筛选：在《中国药典》方法的基础上，比较使用甲醇和乙醇进行提取时的差异。1)药典法[1]：取款冬花标准汤剂干燥粉末1.0 g，精密称定后置具塞锥形瓶中，精确加入10 mL乙醇；称质量，超声处理1.5 h，放冷，再称定质量，用乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液测定。2)甲醇提取法：在上述方法基础上，仅将溶剂乙醇换为甲醇。采用同批次样品 (S5) 进行供试品制备，各制备3份供试品分别测定。结果表明，同批次样品经2种方法制备供试品后，《中国药典》方法所得样品中款冬酮平均质量分数为0.011 9%，甲醇提取所得样品中款冬酮平均质量分数为0.012 0%，含量无明显差异。本研究以甲醇为提取溶剂 (见表2)。

表2 不同提取方法款冬酮含量测定结果 %

2.4.4 线性关系考察 精密移取对照品溶液0.5、1、2、4、8、10 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，按2.4.1方法进样，分别测定款冬酮的峰面积，以进样浓度 (μg·mL-1) 为横坐标X，以峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，得款冬酮回归方程为Y=26 323.81X+ 48.927，r=0.999 9，线性范围为2.78～55.50 μg·mL-1。

2.4.5 精密度试验 取同一份款冬花饮片标准汤剂供试品溶液 (S5)，按2.4.1色谱条件重复测定6次，计算款冬酮峰面积的RSD为0.79%。表明仪器精密度良好。

2.4.6 稳定性试验 取同一份款冬花饮片标准汤剂供试品溶液 (S5)，分别在第0、2、4、8、12、24 h测定，计算款冬酮峰面积的RSD为2.42%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.7 重复性试验 按照2.4.3方法平行制备6份供试品溶液 (S5)，按2.4.1色谱条件测定，计算款冬酮峰面积的RSD为2.74%。表明建立的方法重复性良好。

2.4.8 加样回收试验 取已知含量的款冬花饮片标准汤剂样品 (S5) 6份，精密称定，加入相同量的款冬酮，按照2.4.3项下方法制备供试品溶液，再按照2.4.1方法测定。计算供试品溶液中款冬酮回收率为97.64%～101.10%，平均加样回收率为99.53%，RSD为1.30%，表明该方法的准确度良好。

2.5 款冬花标准汤剂出膏率及转移率

2.5.1 出膏率 本研究通过2.3项下方法制备款冬花标准汤剂干浸膏，按公式(1)计算出膏率(见表3)。结果表明，15批款冬花出膏率为25.20%～44.08%，平均值为36.41%，RSD为4.21%。

出膏率=(干膏质量/饮片质量)×100%

(1)

2.5.2 款冬酮转移率 按照公式(2)计算指标成分款冬酮的转移率 (见表3)，结果表明：15批款冬花标准汤剂中指标成分款冬酮的转移率为0.60%～3.85%，平均转移率为2.01%。

转移率=(标准汤剂中款冬酮含量×出膏率)/饮片中款冬酮含量×100%

(2)

2.5.3 款冬花标准汤剂制备数据 根据以上建立的色谱方法，对15批款冬花标准汤剂进行测定，结果见表3。

表3 款冬花饮片标准汤剂测定结果 %

2.6 指纹图谱的建立

2.6.1 色谱条件 色谱柱为Thermo ODS Hypersil(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为0.03%甲酸溶液 (A) 和乙腈 (B)，梯度洗脱 (0～15 min，3%～15%B；15～20 min，15%～25%B；20～21 min，25%～35%B；21～30 min，35%～85%B；35 min，100%B)；流速为1 mL·min-1；柱温为25 ℃；检测波长为240 nm[18]，进样5 μL，测定，记录对照品和供试品色谱图 (见图2)。

注：A.混合对照品；B.款冬花标准汤剂供试品；6.芦丁；11.款冬酮。图2 混合对照品、款冬花标准汤剂供试品HPLC 图

2.6.2 混合对照品溶液的制备 精密称取款冬酮和芦丁对照品适量，置于容量瓶中，用甲醇溶解定容，配置成每1 mL溶液含25 μg款冬酮、20 μg芦丁的混合对照品溶液。

2.6.3 供试品溶液的制备 按照2.4.3项下方法制备，即得。

2.6.4 方法学考察 精密度试验：取同一份款冬花饮片标准汤剂样品 (S5)，按照2.6.1项下色谱方法连续进样6次，记录色谱图，并以款冬酮色谱峰为参照峰 (11号峰)，结果显示：各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于1.35%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一份款冬花饮片标准汤剂样品 (S5)，分别在0、2、4、8、12、24 h 按2.6.1项下条件进样测定。以款冬酮色谱峰为参照峰 (11号峰)，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明款冬花标准汤剂供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取同一份款冬花饮片标准汤剂样品 (S5) 6 份，按2.6.3项下方法制备供试品溶液，按照2.6.1项下条件测定，以款冬酮色谱峰为参照峰 (11号峰)，结果表明：各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 均小于2.7%，表明该方法重复性良好 (RSD<3%)。

2.6.5 样品检测及分析 取上述15批款冬花饮片标准汤剂，分别按2.6.3项下方法制备供试品溶液，再按2.6.1项下色谱条件测定，记录色谱图。将15 批供试品色谱图分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”(版本：2012.130723)，时间窗设为0.1，采用中位数法生成对照指纹图谱 (见图3)，其中共有峰11个，通过对照品比对指认2个，分别是6号峰 (芦丁) 和11号峰 (款冬酮)。S1～S15指纹图谱与共有模式对照指纹图谱相似度分别为：0.937、0.990、0.981、0.996、0.990、0.992、0.963、0.981、0.986、0.983、0.992、0.988、0.983、0.981、0.994，均在0.90以上，符合指纹图谱相似度要求，表明各批次款冬花饮片标准汤剂具有较好的一致性 (见表4)。

3 讨论

汤剂是中医临床最常用的传统剂型之一，在治疗和预防疾病方面发挥着重要作用。但传统汤剂煎煮工艺粗放、携带服用不便、质量不均和监管困难等问题也日益凸显，特别是《中国药典》规定的药材及饮片质量标准难以直接反映汤剂的质量，因此开展汤剂标准化研究对于中药的临床应用具有重要意义[23]。2016 年，陈士林等[24]提出采用中药饮片标准汤剂来标化不同用药形式，以提高临床用药的准确性和疗效的一致性。中药饮片标准汤剂的制备必须以中医药理论为指导，与临床实际应用保持一致 (传统用药习惯、煎煮方法及服用方法等)。同年，国家药典委员会发布了《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求 (征求意见稿)》为中药饮片标准汤剂的研究提供了重要参考依据。

注：A.款冬花饮片标准汤剂指纹图谱；B.对照指纹图谱。图3 15批款冬花饮片标准汤剂HPLC指纹图谱及其对照指纹图谱

表4 15批款冬花饮片标准汤剂指纹图谱相似度

本研究所采用的款冬花饮片标准汤剂制备工艺是遵照《要求》中的相关规定，经煎煮、固液分离、低温减压浓缩、冷冻干燥后制得。本研究共收集了3个产地15批款冬花饮片样品，样品具有一定的代表性。在实验前对饮片进行了检测，样品符合2015年版《中国药典》款冬花中的规定，同时在标准汤剂的制备过程中遵循统一的标准化操作，以保障所得标准汤剂具备衡量临床不同用药形式的能力。

款冬花中含有的特征性成分为倍半萜类化合物，目前，已从款冬花中发现的此类化合物仅有10余个，其中款冬酮为此类型成分中含量较高的化合物[25]，2015 年版《中国药典》将款冬酮作为款冬花药材和饮片含量测定的指标成分，并规定该成分质量分数不得少于0.070%。考虑到款冬酮的特征性及与《中国药典》中款冬花饮片含量测定的一致性，本研究选择款冬酮作为指标成分，用于款冬花饮片标准汤剂质量标准的建立。但实验结果表明，以款冬酮计算的15批款冬花饮片标准汤剂转移率为0.60%～3.85%，平均转移率为2.01%，转移率较低，这与文献报道的脂溶性成分在标准汤剂中的转移率较低相一致[23，26]。该结果进一步提示，在中药产品如标准汤剂和配方颗粒等的质量控制中，要充分考虑到产品的组成成分与药材或饮片不同，其质量评价方法不能完全参照《中国药典》规定的药材或饮片的质控方法，特别是选择脂溶性成分为指标时，需要慎重。

此前，关于款冬花多指标成分含量测定及指纹图谱的研究虽已有报道[18，27]，但研究多针对其醇提取部位，未能较好地反映其传统用药形式——汤液的质量。本研究构建了款冬花水煎液的HPLC指纹图谱方法，结果表明该方法简便准确、重复性好，可用于款冬花标准汤剂的质量控制。通过对15批款冬花饮片标准汤剂指纹图谱进行比较发现，其共有峰11个，且相似度良好，表明所得款冬花标准汤剂化学轮廓相似度高。

总之，本研究根据《要求》中相关描述，确定了款冬花标准汤剂制备的相应工艺参数，制备了15批不同产地的款冬花饮片标准汤剂，并从指标性成分的测定及其转移率、出膏率和指纹图谱建立方面进行了系统研究，研究结果可为款冬花标准汤剂和配方颗粒的制备及质量控制提供参考，同时也为款冬花的不同临床用药形式之间的评价提供数据资料。