HPLC波长切换法同时测定舒尔经胶囊中7种指标性成分的含量

黄砚，杨俊卿

1.电子科技大学医学院 附属妇女儿童医院/成都市妇女儿童中心医院 国家药物临床试验机构，四川 成都 611731；2.重庆医科大学 药学院，重庆 400016

舒尔经胶囊由香附、白芍、赤芍、延胡索、柴胡、当归、牡丹皮等11味中药加工而成，具有疏肝活血、调经止痛的功效，临床上主要用于痛经、月经失调属气滞血瘀证的治疗[1]，现代研究表明，舒尔经制剂可以提高去卵巢大鼠血清中雌二醇和孕酮的含量，改善血液流变性，明显增加子宫系数，改善子宫和阴道的病理学变化，降低大鼠正常子宫活动的频率，显著抑制缩宫素引起子宫平滑肌收缩的频率及收缩强度[2]，对大鼠子宫肌瘤具有一定的抑制作用，对痛经有较强的镇痛作用[3]；舒尔经制剂对原发性痛经[4]、经前期综合征[5]、气滞血瘀型痛经[6-7]等疾病临床效果显著，且不良反应少。舒尔经胶囊现行质量标准为国家食品药品监督管理局国家药品标准WS-10704(ZD-0704)-2002-2012Z，标准仅对方中延胡索所含延胡索乙素进行定量研究，中成药复方制剂由多味中药加工而成，每味中药含有多种活性成分，单一成分难以全面评价舒尔经胶囊产品质量，本研究参考中药质量标志物以君药为主，兼顾臣佐使药的确定原则，采用波长切换技术，选取舒尔经胶囊方中君药香附所含标志性成分α-香附酮，臣药白芍，佐药赤芍、牡丹皮所含代表性成分氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷，佐药延胡索所含主要活性成分延胡索乙素、紫堇碱、四氢小檗碱为定量测定研究指标，为舒尔经胶囊多指标控制质量标准的提高和完善提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪；电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2 试药

芍药苷对照品(批号：110736-201842，物质数字识别号码：23180-57-6，纯度：97.4%)、α-香附酮对照品(批号：110748-201815，物质数字识别号码：473-08-5，纯度：99.7%)、延胡索乙素对照品(批号：110726-201819，物质数字识别号码：2934-97-6，纯度：99.8%)均来源于中国食品药品检定研究院；氧化芍药苷对照品(批号：14062505，物质数字识别号码：39011-91-1，纯度：99.95%)、四氢小檗碱对照品(批号：PRF8050941，物质数字识别号码：522-97-4，纯度：98.81%)均来源于成都普瑞法科技开发有限公司；芍药内酯苷对照品(批号：18040323，物质数字识别号码：39011-90-0，纯度：98.5%)、紫堇碱对照品(批号：17110821，物质数字识别号码：518-69-4，纯度：99.6%)来源于上海同田生物技术股份有限公司；乙腈为色谱纯；其他试剂为分析纯。

舒尔经胶囊(规格：每粒装0.5 g，批号分别为：180601、180901、181004)来源于海南博大制药厂。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相A：乙腈，流动相B：0.1%冰醋酸溶液，梯度洗脱(0～16.0 min，15.0%A；16.0～33.0 min，15.0%～38.0%A；33.0～42.0 min，38.0%～70.0%A；42.0～67.0 min，70.0%～78.0%A；67.0～75.0 min，78.0%～16.0%A)；检测波长分别为230 nm[8-10](0～33.0 min检测氧化芍药苷、芍药内酯苷和芍药苷)、242 nm[11](33.0～42.0 min检测α-香附酮)和280 nm[12-14](42.0～75.0 min检测延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱)；体积流量：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液及样品的制备

2.2.1 对照品储备溶液 精密称取氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱各对照品适量，用70%乙醇制成单组分对照品储备溶液(氧化芍药苷0.858 mg·mL-1、芍药内酯苷3.414 mg·mL-1、芍药苷5.198 mg·mL-1、α-香附酮0.672 mg·mL-1、延胡索乙素0.294 mg·mL-1、紫堇碱0.238 mg·mL-1、四氢小檗碱0.192 mg·mL-1)。

2.2.2 混合对照品溶液 分别精密量取各单组分对照品储备溶液2.5 mL，置同一50 mL量瓶中，用70%乙醇制成混合对照品溶液(氧化芍药苷42.9 μg·mL-1、芍药内酯苷170.7 μg·mL-1、芍药苷259.9 μg·mL-1、α-香附酮33.6 μg·mL-1、延胡索乙素14.7 μg·mL-1、紫堇碱11.9 μg·mL-1、四氢小檗碱9.6 μg·mL-1)。

2.2.3 舒尔经胶囊样品溶液 取舒尔经胶囊适量，倾出内容物，混匀，取约1.0 g，精密称定，精密加70%乙醇25 mL，密塞，称质量，加热回流[8-9，12-14]提取45 min，放冷，用70%乙醇补足减失质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得舒尔经胶囊样品溶液。

2.2.4 阴性样品溶液 按舒尔经胶囊处方比例及制备工艺，分别制备缺香附阴性样品、缺延胡索阴性样品和缺白芍、赤芍、牡丹皮阴性样品，再按2.3项下方法制备3种阴性样品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适应性试验 分别精密吸取混合对照品溶液、舒尔经胶囊样品溶液和3个阴性样品溶液适量，按照2.1项下色谱条件依法进样测定，记录色谱图。结果所记录色谱图基线平稳，待测成分氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱与其他峰均能达到有效分离，分离度均大于1.5，理论塔板数按所测定色谱峰计均>4000，3种阴性样品对测定无干扰，色谱图见图1。

注：A.混合对照品；B.舒尔经胶囊样品；C.缺白芍、赤芍、牡丹皮阴性样品；D.缺香附阴性样品；E.缺延胡索阴性样品；1.氧化芍药苷；2.芍药内酯苷；3.芍药苷；4.α-香附酮；5.延胡索乙素；6.紫堇碱；7.四氢小檗碱。图1 混合对照品和舒尔经胶囊HPLC图

2.3.2 线性关系考察 精密吸取2.2.1项下单组分对照品储备溶液各2.0 mL，置于20 mL量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度，制成线性关系考察混合对照溶液，再精密吸取线性关系考察混合对照溶液A各适量，用70%乙醇分别稀释2、4、8、16、20倍，制成系列浓度的线性关系考察混合对照溶液，依法进样，测定氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱的峰面积，以氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱的质量浓度分别对相应峰面积进行线性回归，回归方程、r、线性范围见表1。

表1 舒尔经胶囊7种成分的回归方程、r及线性范围 μg·mL-1

2.3.3 精密度试验 取2.2.2项下的混合对照品溶液，按照上述色谱条件进行测定，连续进样6次，记录氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱的峰面积，RSD以其峰面积计分别为0.88%、0.74%、0.60%、0.95%、1.07%、1.14%和1.25%。

2.3.4 重复性试验 取同一批次舒尔经胶囊适量，按照2.2.3项下方法平行制备样品溶液6份，再按照上述色谱条件进行测定，计算氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱含量，RSD以其含量计分别为1.20%、0.43%、1.01%、1.35%、1.47%、0.82%和1.26%。

2.3.5 稳定性试验 取同一份样品溶液，室温下0、2、4、6、10、16 h，按照上述色谱条件进行测定，记录氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱的峰面积，结果舒尔经胶囊样品溶液室温下16 h内稳定，待测成分峰面积的RSD分别为0.79%、0.65%、0.54%、1.03%、1.12%、0.18%和1.46%。

2.3.6 加样回收率试验 取同一批次已知含量的舒尔经胶囊适量，倾出内容物，混匀，取9份，每份0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入对照品溶液(氧化芍药苷0.278 mg·mL-1、芍药内酯苷1.148 mg·mL-1、芍药苷1.782 mg·mL-1、α-香附酮0.244 mg·mL-1、延胡索乙素0.106 mg·mL-1、紫堇碱0.084 mg·mL-1、四氢小檗碱0.052 mg·mL-1)1.0 mL 3份、2.0 mL 3份、3.0 mL 3份(约相当于样品含量的50%、100%、150%)，按照2.2.3项下方法制备加样回收样品溶液。按照上述色谱条件进行检测，计算回收率及相应的RSD，检测计算结果见表2。

2.3.7 样品含量测定 取3批次的舒尔经胶囊适量，按2.2.3项下方法每个批次平行制备3份舒尔经胶囊样品溶液，在2.1色谱条件下依法进样测定氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱的峰面积，计算待测成分含量，结果见表3。

表2 舒尔经胶囊7种成分的回收率(n=9)

续表2

表3 舒尔经胶囊中7种成分含量测定结果 mg·g-1

3 讨论

待测成分的选择：舒尔经胶囊由香附、白芍、赤芍、延胡索、柴胡、当归、牡丹皮等11味中药加工而成，方中香附疏肝解郁、调经止痛，为君药；白芍养血柔肝、理气止痛，当归活血补血，柴胡疏肝升阳，合为臣药；赤芍、牡丹皮、桃仁清热凉血、活血化瘀，延胡索、益母草活血止痛，陈皮理气健脾，合为佐药；牛膝逐瘀通经、引血下行，为使药。诸药合奏，共达疏肝活血、调经止痛之功效。本研究参考中药质量标志物以君药为主，兼顾臣佐使药的确定原则，选取君药香附、臣药白芍及佐药赤芍、牡丹皮和延胡索为研究对象，香附为莎草科植物莎草的干燥根茎，主要含萜类、黄酮类、酚类、生物碱、挥发油类等化合物，α-香附酮为其特征性成分；白芍为毛茛科植物芍药的干燥根，氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷等单萜类成分为其主要活性成分；赤芍为毛莨科植物芍药或川赤芍的干燥根，牡丹皮为毛莨科植物牡丹的干燥根皮，均含有芍药苷、氧化芍药苷等成分；延胡索为罂粟科植物延胡索的干燥块茎，延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱等异喹啉类生物碱为其主要有效成分。本研究选取舒尔经胶囊香附所含α-香附酮，臣药白芍、佐药赤芍、牡丹皮所含氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷，佐药延胡索所含延胡索乙素、紫堇碱、四氢小檗碱为定量测定指标，为全面评价舒尔经胶囊提供数据支持。

流动相的确定：实验过程中，以待测成分氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱的分离度、色谱峰的尖锐程度、对称程度以及色谱图基线平稳情况等为指标，首先对比考察了甲醇-水流动相体系[11，15]、乙腈-水流动相体系，结果显示，乙腈-水流动相体系下待测成分氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱分离度、峰形及色谱图基线较甲醇-水流动相体系下效果好，但所测成分芍药内酯苷、延胡索乙素和四氢小檗碱色谱峰存在拖尾现象；在此基础上分别考察了乙腈-0.1%冰醋酸溶液流动相体系[9，13]和乙腈-0.1%磷酸溶液流动相体系[8，10，12]，通过对流动相比例的不断摸索研究，最终确定采用乙腈-0.1%冰醋酸溶液为流动相，按照文中2.1项下流动相比例进行梯度洗脱，实现对舒尔经胶囊中氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱的同时测定。

本实验首次建立一种HPLC波长切换法同时测定舒尔经胶囊中氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、α-香附酮、延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱的含量，实现了对舒尔经胶囊多种有效成分的质量控制。