时间:2024-07-28
张红玉,胡松谋,刘剑,王继陈
(云南云河药业股份有限公司,云南 个旧 661000)
龙胆泻肝片质量标准研究
张红玉,胡松谋*,刘剑,王继陈
(云南云河药业股份有限公司,云南 个旧661000)
目的:建立龙胆泻肝片的质量标准。方法:采用显微鉴别法对龙胆、黄芩进行定性鉴别;采用薄层色谱法对龙胆、栀子进行定性鉴别;采用HPLC测定龙胆中龙胆苦苷的含量。结果:显微鉴别特征明显;薄层色谱斑点清晰;龙胆苦苷在0.1048~0.6288μg呈现良好的线性关系,相关系数r>0.999;加样回收率为100.4%(n=6)。结论:该方法准确可靠,可行性及重复性好,可用于龙胆泻肝片的质量标准控制。
龙胆泻肝片;显微鉴别;薄层色谱;高效液相色谱;龙胆苦苷;栀子苷
龙胆泻肝片由龙胆、柴胡、黄芩、栀子(炒)、泽泻、木通、车前子(盐炒)、当归(酒炒)、地黄、甘草(蜜炙)10味中药组成,清肝胆、利湿热,用于肝胆湿热、头晕目赤、耳鸣耳聋、耳肿疼痛、胁痛、口苦、尿赤涩痛、湿热带下等。该制剂中的龙胆清热燥湿、泻肝胆火,为方中君药;栀子泻火除烦、清热利湿、凉血解毒,黄芩清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎,同为方中臣药。为了更好地控制产品的质量,保证临床用药安全,采用显微鉴别法对龙胆、黄芩进行定性鉴别;采用薄层色谱法对龙胆、栀子进行定性鉴别;采用HPLC测定龙胆中龙胆苦苷的含量。
1.1仪器
Agilent1100型高效液相色谱仪;赛多利斯电子天平(BP211D);XSP-44X.9三目生物显微镜(上海光学仪器一厂)。
1.2试药
龙胆苦苷对照品、栀子苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号分别为110770-200712,110749-200309,含量测定用);龙胆泻肝片(云南云河药业股份有限公司,批号为中试01、中试02、中试03);甲醇(色谱纯,J.T.Baker)。
龙胆外皮层细胞表面观纺锤型,每个细胞由横壁分隔成数个小细胞。黄芩韧皮纤维淡黄色,梭形,壁厚,孔沟细[1]。见图1。
注:A.黄芩;B.龙胆。图1 龙胆泻肝片显微特征图
注:1.龙胆泻肝片样品(云河:中试01);2.龙胆泻肝片样品(云河:中试02);3.龙胆泻肝片样品(云河:中试03);4.龙胆苦苷、栀子苷;5.阴性样品(缺龙胆、栀子)。图2 龙胆泻肝片中龙胆、栀子薄层鉴别的二次展开色谱图
栀子、龙胆的薄层色谱鉴别[3]:取本品10片(薄膜衣片除去薄膜衣),研细,加乙醇30mL,超声(功率为250W,频率为33kHz)处理30min,滤过,滤液浓缩成约1mL,加在中性氧化铝柱(120目,2g,内径1.5cm)上,用乙醇洗脱至洗脱液无色,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇1mL使其溶解,作为供试品溶液。另取栀子苷、龙胆苦苷对照品,加甲醇制成质量浓度为4mg·mL-1的栀子苷对照品溶液和质量浓度为1mg·mL-1的龙胆苦苷对照品溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各4μL,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以二氯甲烷-甲醇-水(30∶10∶3)的下层溶液为展开剂,二次展开,取出,晾干,置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。按处方中各味药的比例取不含龙胆、栀子的群药,按制备工艺制备阴性样品后,按供试品溶液的制备方法制成阴性溶液。本法经三批样品试验观察,阴性对照未见干扰。见图2。
4.1色谱条件
AgilentC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);以甲醇-水(22∶78)为流动相[2-4];检测波长为270nm;流速为1mL·min-1;进样量为10μL;理论板数按龙胆苦苷峰计算应不低于2500。
4.2对照品溶液的制备
取龙胆苦苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成质量浓度为50μg·mL-1的溶液,即得。
4.3供试品溶液的制备
取本品(薄膜衣片除去薄膜衣)研细,精密称取0.5g,置50mL量瓶中,精密加入甲醇25mL,称定重量,超声处理(功率为250W,频率为33kHz)45min,取出,放冷,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
4.4阴性溶液的制备
按处方中各味药的比例取不含龙胆的群药,按制备工艺制备阴性样品后,按供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。
4.5专属性试验
取按龙胆泻肝片生产工艺制成缺龙胆的阴性样品0.5g,按4.3项下方法制备阴性对照液,按4.1项下方法测定,结果在与龙胆苦苷对照品色谱相应的保留时间处,供试品溶液色谱图中有吸收峰,而阴性对照色谱图中未显吸收峰,可见溶剂对主成分无干扰,说明本法专属性强。见图3。
注:A.龙胆苦苷对照品;B.龙胆泻肝片样品;C.龙胆泻肝片缺龙胆阴性样品。图3 龙胆泻肝片液相色谱图
4.6线性关系考察
取对照品溶液,在按4.1项下的色谱条件,分别精密量取2、4、6、8、10、12μL注入液相色谱仪,记录色谱图,以进样量对峰面积进行回归。采用的HPLC法测定龙胆泻肝片中龙胆苦苷在0.104 8~0.628 8μg呈良好线性关系,回归方程为Y=0.968 658 624+1 246.154 59X,相关系数r>0.999。
4.7精密度考察
取龙胆苦苷对照品溶液,按4.1项下的色谱条件测定,平行操作6次,记录峰面积,结果龙胆苦苷的RSD为0.38%,表明精密度良好。
4.8重复性考察
取同一批样品(批号为:中试01)分别制备6份供试品溶液,按4.1项下色谱条件测定,记录峰面积,测定结果龙胆苦苷的含量分别为1.728、1.730、1.729、1.729、1.727、1.732mg/片,RSD为0.01%,表明该方法重复性良好。
4.9稳定性试验
取同一批样品(批号为:中试01)供试液,分别于0、4、8、12、24h进行测定,记录峰面积,测定结果龙胆苦苷的含量分别为1.727、1.726、1.728、1.728、1.726,RSD为0.06%,表明供试品溶液在24h内稳定。
4.10加样回收率试验
取同一批样品(批号为:中试01,已知样品中龙胆苦苷的含量为4.2216mg·g-1),研细,取6份,每份约0.25g,精密称定,分别置50mL量瓶中,分别加入龙胆苦苷对照品溶液(质量浓度为0.1264mg·mL-1)5mL,按供试品溶液制备方法制备后,精密吸取10μL,注入液相色谱仪,测定,计算回收率,即得,测定结果见表1。
表1 加样回收率试验
结果表明,龙胆苦苷的回收率均在99.84~102.42%,其他成分对测定无干扰,方法可行。
4.11样品测定
取龙胆泻肝片(批号为:中试01、中试02、中试03),按4.3项下条件制备样品溶液,按4.1项下色谱条件测定龙胆苦苷的含量,以外标法计算,结果均为1.73mg/片。
方中木通薄层色谱鉴别方法[5],因其化学成分为茎枝含木通苷,木通苷极易水解得常春藤皂苷元、齐墩果酸、葡萄糖和鼠李糖,根据其化学成分,用齐墩果酸对照品、常春藤皂苷元对照品作对照,对其鉴别进行了研究。结果显示,龙胆泻肝片由10味中药组成,成分复杂,干扰成分多。在鉴别木通中齐墩果酸时,阴性有干扰,经文献查阅得知,车前子化学成分中含有熊果酸和齐墩果酸,同属三萜酸同分异构体,性质与化学结构较为相似,用TLC法鉴别时很难将其分开,二者相互干扰。按《中华人民共和国药典》2010版一部木通药材项下的方法鉴别常春藤皂苷元时,供试品背景颜色深,斑点层次模糊。采用过大孔树脂柱、中性氧化铝柱等洗脱处理,除去了背景颜色,但斑点模糊,阴性有干扰,专属性差,因此未将其列入质量标准草案正文。
最大吸收波长的选择:取龙胆苦苷对照品,加甲醇使其溶解,制成龙胆苦苷对照品溶液,分别在200~400nm做紫外扫描,从紫外光谱图可以看出,在270nm处龙胆苦苷有较大吸收值,故选择检测波长为270nm。
龙胆苦苷、栀子苷的薄层鉴别中,由于成份复杂,较难分离,经过大量研究,最终确定用高效薄层板,以同一展开剂,展开2次的方法进行分离,得到的结果较理想。
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂:第十二册[S].北京:中国医药科技出版社,1997.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[S]北京:中国医药科技出版社,2010.
[3] 刘颖,胡琴,陶志国.龙胆泻肝颗粒质量标准研究[J].中成药,2013,35(12):2661-2666.
[4] 许仲,叶胜体,张妥.高效液相色谱法测定龙胆泻肝汤颗粒中龙胆苦苷含量[J].中国药业,2012,4(21):54-55.
[5] 刘卫国.木通中齐墩果酸含量及其指纹图谱研究[D].成都:四川工业大学,2005.
QualityStandardforLongdanXieganTablets
ZHANGHongyu,HUSongmou*,LIUJian,WANGJichen
(YunnanYunhePharmaceuticalCo.,Ltd,YunnanGejiu661000,China)
Objective:To establish a quality standard for Longdan Xiegan Tablets.Methods:Microscopic identification was used by qualitative identification ofGentianascabraBge andScutellariabaicalensisGeorgi; TLC was used for qualitative identification ofG.scabraandGardeniajasminoidesEllis; HPLC was used for the determination of gentiopicrin ofG.scabra.Results:Microscopic identification showed obvious characteristics,TLC spots were clear; the linear ranges of gentiopicrin was0.1048~0.6288μg (r>0.999).Rate of recovery was100.4%(n=6).Conclusion:The method is accurate reliable and reproducible and can be used for quality control of Longdan Xiegan Tablets.
Longdan Xiegan Tablets;microscopic identification;TLC;HPLC;gentiopicrin;geniposide
10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.024
2015-08-05)
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胡松谋,主任药师,研究方向:中成药开发与研究;Tel:(0873)2122589,E-mail:393153902@qq.com
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