DNA分子标记在丹参药材质量控制中的应用△

梁从莲，蒲高斌，刘谦，李佳，张永清

(山东中医药大学，山东 济南 250355)

·综述·

DNA分子标记在丹参药材质量控制中的应用△

梁从莲，蒲高斌，刘谦，李佳，张永清*

(山东中医药大学，山东 济南250355)

本文主要介绍了随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性 (AFLP)、相关序列扩增多态性(SRAP)、基于表达序列标签(EST)所建立的简单重复序列标记(SSR)、DNA序列测定技术等分子标记技术在丹参种内遗传多样性、物种演化及其与地理分布关系。分析表明，不同分子标记各有优缺点，建议将多种分子标记相结合或与传统的形态学标记、生物化学标记和细胞学标记相结合，从而为丹参种质资源的收集保存、分类鉴定、药材质量控制、合理开发利用与品种选育等提供理论依据。

DNA分子标记；丹参；质量控制

丹参为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根茎，具有活血通络、祛瘀止痛、凉血消痈、清心除烦等功能，对心血管等疾病作用显著。近年来，市场上时常出现丹参药材以次充好、以假充真的现象，严重威胁着人们的健康与用药安全。建立科学、快速、可靠的丹参药材真伪鉴定技术体系，对于保证其药材质量具有十分重要的现实意义。DNA分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，可直接在DNA水平上检测生物个体之间的差异[1]。目前，已有学者利用RAPD(随机扩增多态性DNA)、AFLP(扩增片段长度多态性DNA)、SRAP(相关序列扩增多态性)、EST-SSR(基于表达序列标签所建立的简单重复序列标记)等分子标记对丹参药材质量控制进行相关研究，本文对此进行了系统归纳、总结，以期为丹参药材质量控制提供参考。

1 随机扩增多态性DNA

RAPD技术是1990年由Wiliam和Welsh等人在聚合酶链式反应(PCR)技术基础上发展起来的检测DNA多态性的方法[2]。利用随机引物(一般为8～10bp)通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增DNA片段多态性，这些片段的多态为反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD技术简单，检测速度快，对DNA样品需求量少，而且可在基因组序列未知的情况下进行。郭宝林等[3](2002)用RAPD分子标记技术对丹参主要居群的遗传关系及药材道地性进行初步研究，结果表明，丹参居群内遗传多样性十分丰富，地区间居群的遗传分化不均衡，并得出了山东及河南产丹参是道地药材的结论。石嫱等[4](2010)用RAPD分子标记技术对内蒙古丹参进行了多态性分析，结果表明，所建立的RAPD体系可用于评价内蒙古产丹参药材质量。叶文静等[5]通过对比十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法和十二烷基磺硫钠(SDS)法对白花丹参DNA的提取结果，认为改良CTAB法更适合用于白花丹参基因组DNA的RAPD检测分析，并初步筛选了RAPD扩增引物。

2 扩增片段长度多态性DNA

AFLP是1995年荷兰科学家Zabeau和Vos等发展起来的一种检测DNA多态性的新方法[6]。其原理是先利用限制性内切酶水解基因组DNA，产生不同大小的DNA片段，然后将这些DNA片段连上特定的人工接头，形成特异片段，作为扩增反应的模板DNA。进而以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加1～3个选择性核苷酸作引物，对模板DNA基因再进行选择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测，获得DNA扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。该标记结合了RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性片断长度多态性)标记与RAPD标记的优点，具有高度重复性，高通量，不需清楚待测序列信息背景的优点，而且它还具备了PCR的高效、安全、方便的特点，只需少量DNA即可对整个基因组进行选择性扩增，且电泳谱带清晰可辨，结果可靠稳定[7]。唐晓清等[8]用AFLP分子标记技术对4种不同种质丹参进行分析，结果表明，丹参种内不同类型间的遗传差异较大，其遗传多样性丰富。根据聚类分析结果初步将小叶型丹参确定为一个变种，丹参原型与皱叶型丹参也可初步定为丹参的栽培变种，认为AFLP技术可作为鉴别丹参种内不同类型的手段。王冰等[9]用AFLP分子标记技术对我国27个不同地理居群的丹参样本进行遗传多样性分析，发现我国野生丹参居群间存在较高多态性，遗传多样性较为丰富。实验中采用10对引物便可正确识别27个居群丹参，表明AFLP指纹图谱数据在丹参种质资源识别和区分上表现出高分辨率，足以用于丹参种内分类、演化及其与地理分布间关系的研究。数据处理绘制出的进化树显示出8个显著不同的与来源地密切相关的演化群。聚类分析结果显示，不同丹参居群间遗传距离与空间距离之间的关系较为复杂。温春秀等[10]采用AFLP标记在DNA水平上对丹参种质资源进行遗传多样性研究，在选择的6对引物组合中，不同的引物组合所得到的扩增片段数平均为79条带，多态性扩增片段平均为68条带，多态位点百分比平均达到86.7%。郝岗平等[11]利用AFLP分子标记技术对山东产丹参进行了基因组DNA多态性分析，结果表明，山东产丹参具有一定的遗传多样性，结合聚类分析进一步探讨了供试类群的亲缘关系，为研究山东丹参的道地性及其合理利用与保护奠定了基础。杨建玉等[12]采用AFLP分子标记技术对北京地区鼠尾草属的7个种23份样本进行了亲缘关系分析，结果表明，所研究的鼠尾草属植物具有较高的多态性。聚类分析将23份样本分为7大组，符合植物材料归属于鼠尾草属7个种的事实，表明AFLP分子标记技术适用于鼠尾草属植物亲缘关系分析。

3 相关序列扩增多态性

SRAP是由美国加州大学Li和Quiros于2001年建立的一种新型分子标记，它结合了RAPD和AFLP二者的优点，利用独特的引物设计对ORFs(openreadingframes，开放读码框)进行扩增，因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性，具有简便、稳定、中等产率和容易得到选择条带序列的特点，在基因组中分布均匀，适合基因定位、基因克隆、遗传图谱构建等生物学研究[13]。自建立以来已在多种植物研究中得到成功应用。有研究[14-15]通过摸索建立了丹参SRAP扩增反应体系的最优条件，并将SRAP分子标记技术应用到丹参遗传多样性研究中。用36对多态性引物组合对6个丹参种群进行分析，产生了782条多态性条带，初步证明了SRAP分析方法具有较高的准确性和可靠性。聚类分析显示，不同丹参种群间遗传距离与空间距离之间的关系较为复杂。王维婷等[16]在李延春等人研究基础上增加了丹参数量，利用SRAP分子标记技术对48个不同来源的丹参种质进行遗传多态性分析，在120条DNA扩增条带中有109条带呈多态性，占所观察到的总条带的90.83%，说明所研究的48份丹参种质具有丰富的遗传多态性。聚类分析结果显示，不同产地丹参种质遗传多样性不同，遗传距离与空间距离存在着一定相关性。

4 基于表达序列标签所建立的简单重复序列标记

EST-SSR是基于表达序列标签所建立的简单重复序列标记，传统SSR标记的开发通常需经过文库构建，包括SSR克隆筛选、测序、引物设计和PCR扩增与分析等步骤，要投入大量的人力物力，开发成本高。从EST中开发的SSR标记(EST-SSR)与基因组SSR相比，反映了基因组的编码区域，可直接获得基因表达信息，为功能基因提供“绝对”标记，这有可能对决定重要表型性状的等位基因进行直接鉴定，省去了SSR引物开发过程中的克隆和测序步骤，充分利用了现有测序数据，降低了开发成本[17]。该技术在不同物种间通用性好，具有较高的转移性。多项研究表明，丹参EST的数量较多[18]，故对其进行SSR挖掘，分析其分布规律以建立EST-SSR标记体系，具有较大的意义和可行性。宋杰等[19]对丹参EST中的SSR信息进行了全面分析，并在此基础上建立了丹参EST-SSR分子标记。在10228条丹参EST序列中搜索到含有SSR位点的序列1790条。对其加以分析发现，丹参的EST-SSR信息比较丰富，覆盖了从单核苷酸重复到六核苷酸重复，认为单核苷酸是主要重复类型，其中二、三核苷酸中基元(AG)n、(ACG)n是SSR的主要重复类型。利用已筛选出的7对引物对11个丹参不同产地样品进行PCR扩增，结果均有良好的多态性。由此可见，利用EST序列信息建立丹参EST-SSR分子标记是切实可行的。邓科军等[20]对丹参EST进行SSR标记挖掘，并对这些EST-SSR在丹参转录组中的分布特征进行全面分析，同样得出了丹参EST-SSR信息种类比较丰富的结论，只是各核苷酸出现的频率不同。认为二、三核苷酸是SSR的主要类型，其中(AG)n、(AGT)n是SSR的主要重复类型。在此基础上开发了丹参EST-SSR标记，所有引物均显示多态性扩增，经丹参居群间多样性分析及鼠尾草属种间可转移性验证，可有效扩增引物在鼠尾10个异源物种中的可转移率为60%～100%，平均为85%。聚类分析结果显示，EST-SSR分析可明确区分丹参及其他同属植物。有研究[20-21]对NCBI(美国国家生物技术信息中心)数据库中丹参EST中的SSR信息进行发掘比对，统计分析丹参SSR在不同长度EST中的发生频率和特点，发现丹参EST中SSR基元类型有4种，二核苷酸与三核苷酸是丹参SSR的主要基元类型，其中(AG)n、(AAG)n是SSR的主要重复类型，显示丹参EST-SSR具有较高的多态性和实用性。王学勇等[22]采用不同于邓科军等人的设计参数和引物设计软件，对最新共计10408条丹参EST序列中的SSR进行搜索，并对其分布规律进行更广泛和深入分析，建立了覆盖度更高的EST-SSR新型分子标记体系，为探索该标记在丹参道地品质遗传研究和分子育种中的应用奠定了基础。多位学者关于丹参EST中SSR位点的分布特征的研究结果存在一定差异，这可能与研究过程中对NCBI数据库中EST的搜索范围设置存在差异，所采用的EST序列预处理软件及预处理方法不一致，以及对SSR基元的归类统计方法不同有关系。宋振巧等[23]对4个产地共80个丹参株系种质资源进行EST-SSR分析，发现栽培丹参具有丰富的遗传多样性，各产地丹参遗传分化程度低，遗传变异主要存在于产地内部。

5 DNA序列测定技术

ITS区即rRNA基因转录间区，具有高度重复性、长度变异少、区内变异度高等特性，故常作为植物核基因组DNA测序的基因，其中ITS2序列作为药用植物通用条形码已在多种药材基原物种及其混伪品的鉴定工作中得到良好应用[24]。DNA序列测定技术是以DNA序列为核心的分子标记技术，通过比较DNA分子中4种碱基序列排列顺序的变化，可反映生物体遗传上的差异，不但直观性强，而且重现性好，结果准确可靠[25]，已被广泛应用于被子植物系统发育和分类学研究。汪红等[26]对丹参ITS片段进行遗传多样性分析，最终获得了核糖体DNA中ITS和5.8S完整序列，通过对比鼠尾草属植物种间、丹参种内和外类群ITS1和ITS2序列差异百分率，可看出两段序列在丹参种内保守，在属间有较大差异，与外类群差异最大，可作为丹参分子鉴定标记。王迎等[27]也对鼠尾草属药用植物及其近缘种的ITS序列进行分析，结果显示，5.8S序列十分保守，而ITS区段则在亚属间差异明显。ITS系统树对于亚属和组的处理较为合理，但对组下的划分则表现出信息量不足，需要其他相关证据的支持。ITS分析支持了丹参组内其他近缘种作为丹参类药材替代资源的合理性，同时也揭示了甘西鼠尾类高山丹参在遗传上与丹参类药材的显著不同。刘灵娣等[28]比较了28份不同来源丹参种质的ITS序列，序列分析表明，ITS区的变异主要发生在内转录间隔区ITS1和ITS2区，ITS序列在丹参种内比较保守。聚类分析发现，采用rDNA-ITS方法可将28个丹参材料明确划分，表明此方法在丹参资源材料识别与区分上表现出高分辨率，足以用于丹参种内分化、演化及其与地理分布间关系的研究，可以作为鉴别丹参不同类型间遗传变异的手段。

6 其他分子标记技术

除以上分子标记技术外，一些学者也尝试利用其他分子标记方法，或结合两种分子标记技术对丹参进行研究。2007年徐红等[29]采用ISSR(InterSimpleSequenceRepeat，简单重复间隔序列)分子标记对不同产地丹参亲缘关系进行研究。ISSR标记是以PCR技术为基础的，它在技术上比SSR简单，不需知道基因组序列即可设计引物并进行扩增，同时又可比RFLP、RAPD、SSR等分子标记技术揭示的遗传多态性更多，具有模板需要量少、结果记录方便、稳定性高等特点。结果显示，丹参具有丰富的遗传多样性，其遗传变异与地理分布没有明显相关性，提示丹参产区之间的遗传分化不明显。2008年徐红等[30]把RAPD和ISSR相结合，对多个不同产地的野生与栽培丹参进行遗传多样性分析，得出不同产地间的丹参存在丰富的遗传多样性的结论。分析不同产地丹参遗传背景与遗传关系发现，地理距离相近的丹参没有聚类在一起，表明遗传分化与地理分布的相关性不显著，进一步验证了其单独使用ISSR的研究结果。2009年王庆浩等[31]采用新型分子标记TRAP(TargetRegionAmplifiedPolymorphism，目标区域扩增多态性)对不同产地丹参进行研究，建立了丹参鉴别新方法。TRAP技术由SRAP技术发展而来，它使用了SRAP的任意引物，但TRAP的固定引物根据基因库中的EST序列设计而来，具有灵敏度高、特异性强、谱带清晰、结果稳定的优点。但得出了不同地区间丹参遗传分化并不十分显著的结论，其原因有待进一步探讨。2011年褚会娟等[32]以陕西野生丹参为材料，利用正交设计对MSAP(MethylationSensitiveAmplificationPolymorphism，甲基化敏感扩增多态性)预扩增和选择性扩增体系中关键因素优化筛选，建立了适合丹参的MSAP反应体系，分析了5个野生丹参居群表观遗传多样性，发现野生丹参存在着十分丰富的遗传多样性。聚类分析中4个原生居群内每10个单株都能按照地理分布聚成相对独立的分支，且没有交叉现象，而另一个位于耕作活动频繁的采样地的10个单株未能聚在一起，说明人为因素的影响也会打破地理隔离的障碍，引起基因的异常流动。2012年张逸等[33]分别采用AFLP和MSAP两种分子标记技术对秦巴山区5个野生丹参居群的遗传多样性和表观遗传多样性进行比较研究，发现野生丹参居群间的亲缘关系与其地理分布之间有明显相关性。分子方差分析结果表明，丹参居群内变异百分率大于居群间变异百分率，说明丹参变异主要存在于居群内，居群间有一定程度的变异。2012年王海等[34]利用叶绿体微卫星分子标记法[35]分析了丹参遗传特征，发现丹参在细胞质遗传上总体均体现为中等水平，而在不同地区间则存在差异。各省区间丹参的遗传变异以种群间的遗传变异为主，说明由于人类活动的干扰，各省区间的基因交流较明显，在遗传分化方面未显示地理相关性。2013年徐海滨等[36]采用生物信息学方法，从丹参基因组框架图序列中发掘出4832个长度超过40bp的基因组SSR位点，发现相同位点的SSR重复基元的重复次数在不同个体间变异较大，可作为筛选品种间遗传多样性的重要分子标记来源。相对于其他类型的分子标记，SSR标记为共显性标记，其实验操作简单且在基因组中分布广泛，目前已成为一类广泛应用的分子标记。发掘出的基因组SSR位点在位点数量和序列长度上，均明显优于前人利用EST序列筛选EST-SSR位点的分析结果。而长片段SSR位点在进化中会有更高的概率产生长度变异，故而这些基因组SSR位点的筛选更加有利于丹参群体基因组多态性的发掘，为丹参分子育种工作提供重要资源。

7 小结

以上多种分子标记各有特点，但也存在不足之处，如RAPD为显性标记，故而不能区分杂合子和纯合子，其凝胶电泳存在共迁移问题，即只能分开不同长度DNA片段，而不能分开那些分子量相同但碱基序列组成不同的DNA片段，且RAPD易受多种因素影响，稳定性和重复性较差；而SSR虽然为共显性标记，可以区分杂合子和纯合子，但SSR标记的引物开发成本较高，且SSR具有较强的种特异性；AFLP标记结果有一定的稳定性，但该技术操作步骤繁琐、技术要求较高。相对来说，ISSR和SRAP缺点较少，其中ISSR多为显性标记，SRAP只是随机地分布在基因组上。而理想的分子标记必须达以下几个要求：1)具有高的多态性；2)共显性遗传；3)能明确辨别等位基因；4)遍布整个基因组；5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；6)选择中性(即无基因多效性)；7)检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；8)开发成本和使用成本尽量低廉；9)在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。随着分子标记技术的发展，新研发的分子标记越来越理想。广大学者应借助先进的分子标记技术对丹参展开研究，可以将多种分子标记相结合或与传统的形态学标记、生物化学标记和细胞学标记相结合，以克服其存在的缺点，进而建立准确、简便、快速的丹参鉴别方法，规范丹参药材市场，提高丹参药材质量。

通过梳理前人对于丹参分子标记的相关研究可以看出，当前分子标记主要用于丹参遗传多样性的研究，而且无论采用何种分子标记手段，都能得出丹参具有较高遗传多样性的结果，但遗传多样性多表现在居群内。丰富的遗传变异为良种选育奠定了良好的基础，然而目前丹参的育种工作处于起步阶段，不同来源丹参之间的亲缘关系尚不明确，急需对其进行深入研究。从聚类分析对丹参居群间的亲缘关系与其地理分布之间关系的研究上来看，不同学者得出的结论不同，这可能与研究者所用分子标记方法不同，研究材料数目不同有一定关系。此外，栽培丹参由于存在人为因素，如引种、选育等的影响，与地理分布的关系更为复杂，若与野生品分开研究，结果可能更清晰。

综上所述，DNA分子标记可用于丹参种内分类、演化及其与地理分布间关系的研究，为丹参种质资源的收集保存、分类鉴定、合理开发利用与品种选育等提供科学的理论依据，同时为建立丹参药材及其优良品种的DNA指纹图谱奠定基础。

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ApplicationofDNAMolecularMarkersinQualityControlofSalviamiltiorrhiza

LIANGConglian，PUGaobin，LIUQian，LIJia，ZHANGYongqing

(ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,250355,China)

This paper mainly introduces DNA molecular markers including RAPD，AFLP SRAP，EST-SSR，DNA sequencing and so on in the study of genetic diversity within species，the speciational evolution and the relationship with geographical distribution ofSalviamiltiorrhiza.The analysis result indicates that different DNA molecular markers have merits and demerits，so we think that the combination of different molecular markers or with traditional morphological markers，biochemical markers and cytological markers may provide a theoretical basis for collection，conservation，classification，identification，quality control of medicinal materials，reasonable development，utilization and the variety breeding ofS.miltiorrhiza.

DNA molecular markers；Salviamiltiorrhiza；quality control

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.026

2015-07-07)

山东省科技发展计划项目(2008GG2NS02022)；山东省现代农业产业技术体系中草药产业创新团队建设项目(2015)；山东省高等学校科技计划项目 (J15LM55)

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张永清，教授，博士生导师，研究方向：中药资源及其质量控制；E-mail：zyq622003@126.com