HPLC-DAD同时测定养肝解毒丸中5种活性成分的含量△

孙强，刘斌，杜海云

（泰安市食品药品检验检测中心，山东 泰安 271000）

养肝解毒丸是由龙胆草、夏枯草、熟地黄、五味子、山茱萸、牡丹皮等十二味中药组成的复方制剂，有滋肾、解毒之功效，用于慢性肝炎，转氨酶持续不降者。龙胆草其有效成分龙胆苦苷对肝脏化学损伤和免疫损伤有保护作用[1-2]；夏枯草具有清肝泻火、明目的作用，迷迭香酸作为其指标性成分[3-4]；五味子具有滋补、强身、安神的作用，五味子醇甲为其指标性成分[5]；山茱萸具有免疫调节、降低血糖、抗菌、抗炎等作用[6-7]，马钱苷为其指标性成分；牡丹皮主要活性成分丹皮酚具有保护肝肾、抗炎、解热等多种药理作用[8-9]。本研究以龙胆草中的龙胆苦苷、夏枯草中的迷迭香酸、五味子中的五味子醇甲、山茱萸中的马钱苷、牡丹皮中的丹皮酚为定量指标，同时对养肝解毒丸中的多种成分的含量测定方法进行研究。本实验根据5种成分紫外吸收特征的不同，采用高效液相色谱-二极管阵列检测器检查法，在3个紫外波长下，同时测定5种活性成分的含量。结果表明，本法结果准确，重现性好，分离效果好，可为养肝解毒丸的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AD高效液相色谱仪（日本岛津公司），SPD-M20A二极管阵列检测器（日本岛津公司），LC solution工作站；十万分之一电子天平（Mettler Toledo XS205DU）

1.2 试药

龙胆苦苷对照品（批号：110770-201314）、五味子醇甲对照品（批号：110857-201412）、马钱苷对照品（批号：111640-201005）、丹皮酚对照品（批号：110708-201005）、迷迭香酸对照品（批号：111871-201505），均购自中国食品药品检定研究院；养肝解毒丸（鲁药制字Z09080126，批号：171026、171109、180101）；甲醇为色谱纯，磷酸等均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Hss C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇（A）-0.5%磷酸水溶液（B），采用梯度洗脱（0～10 min，30%A；10～20 min，30%～40%A；20～30 min，40% ～80%A；30～40 min，80%～30%A）；检测波长：马钱苷、五味子醇甲240 nm，龙胆苦苷、丹皮酚275 nm，迷迭香酸330 nm；流速：1.0 mL·min－1；柱温：30℃；进样量：10μL。龙胆苦苷、马钱苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲的分离度均大于1.5，理论塔板数均不低于6000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 分别精密称取龙胆苦苷、马钱苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲对照品适量，分别加80%甲醇制成质量浓度为560、456、203、682、218μg·mL－1的对照品贮备液。再分别精密量取贮备液适量，加80%甲醇制成含龙胆苦苷、马钱苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲分别为56.0、45.6、20.3、68.2、21.8μg·mL－1的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取本品，研细，精密称定1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醚30 mL，超声处理（功率300 W，频率50 KHz）15 min，放冷，过滤，取滤渣晾干后备用。将滤渣至于锥形瓶中精密加入80%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率300 W，频率50 KHz）30 min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性对照样品溶液 按制剂制备方法，分别制备不含龙胆草、山茱萸、夏枯草、牡丹皮、五味子的阴性样品，按2.2.2项下的制备方法制备阴性对照溶液。

2.3 空白试验

按上述色谱条件，分别取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照样品溶液各10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明：阴性对照样品溶液在与龙胆苦苷、马钱苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲对照溶液相同保留时间处无干扰峰出现，处方中其他药味对测定结果无影响。HPLC图见图1～7。

图1 养肝解毒丸对照品HPLC图

图2 养肝解毒丸样品HPLC图

图3 缺龙胆草阴性对照样品HPLC图

图4 缺山茱萸阴性对照样品HPLC图

图5 缺夏枯草阴性对照样品HPLC图

图6 缺牡丹皮阴性对照样品HPLC图

图7 缺五味子阴性对照样品HPLC图

2.4 线性关系考察

分别精密吸取龙胆苦苷、马钱苷、迷迭香酸、丹皮酚、五味子醇甲储备液各0.1、0.5、1、2.5、5 mL分别置10 mL量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，制成不同浓度的混合对照品溶液，依法测定，记录色谱图，量取峰面积。以峰面积 Y对浓度X（μg·mL－1）进行线性回归，龙胆苦苷、马钱苷、迷迭香酸、丹皮酚、五味子醇甲的回归方程分别为：Y＝1.034×104X＋1.120×103（r＝0.999 6）、Y＝3.005×104X－1.703×103（r＝0.999 8）、Y＝3.604×104X＋2.322×103（r＝0.999 3）、Y＝7.876×104X＋1.024×103（r＝0.999 5）、Y＝5.107×104X－1.084×103（r＝0.999 7），龙胆苦苷、马钱苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲的线性范围分别为 5.60～280、4.56～228、2.03～101.5、6.82～341、2.18～109μg·mL－1。

2.5 精密度试验

取混合对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积，以峰面积考察精密度，龙胆苦苷、马钱苷、迷迭香酸、丹皮酚、五味子醇甲面积的RSD分别为0.3%、0.6%、0.5%、0.4%、0.6%。

2.6 重复性试验

按2.2.2项下，平行制备同一样品（批号：180101）6份，依上述色谱条件依法进行测定，并分别计算含量，龙胆苦苷、马钱苷、迷迭香酸、丹皮酚、五味子醇甲的含量平均值分别为1.08、0.87、0.37、1.24、0.38 mg·g－1，RSD分别为 0.7%、0.9%、0.6%、0.5%、0.8%。

2.7 稳定性试验

取供试品，按照2.2.2项下方法处理，依上述色谱条件分别在0、2、4、6、8、10、12 h依次进行测定，龙胆苦苷、马钱苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲面积的RSD分别为0.4%、0.5%、0.6%、0.3%、0.6%。

2.8 回收率试验

精密称取已知含量的样品1.0 g，共6份，分别精密加入龙胆苦苷、马钱苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲对照品贮备液2.0 mL，照2.2.2项下方法制成加样回收供试液，依上述色谱条件依法进行测定，并分别计算回收率，结果见表1。

表1 回收率试验结果（n＝6）

2.9 样品测定

取本品3批样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图，用外标法分别计算样品中龙胆苦苷、马钱苷、迷迭香酸、丹皮酚和五味子醇甲的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝3）

3 讨论

3.1 检测波长的选择

养肝解毒丸由十二味中药组成，为了能同时检测5种活性成分，采用二极管阵列检测器，多波长检测各成分的含量。龙胆苦苷在275 nm波长处有最大吸收，灵敏度高，无干扰峰，丹皮酚在202、275、314 nm波长处有最大吸收，因此选择275 nm作为它们共同的测定波长；马钱苷在240 nm波长处有最大吸收，五味子醇甲在240～250 nm波长范围内均有很大吸收，在此波长下马钱苷、五味子醇甲吸收值高，分离度好，因此选择240 nm为两者的测定波长；迷迭香酸在203、280、330 nm波长处有最大吸收，从图2看出在330 nm处灵敏度高，无干扰峰，故选择此波长检测。

3.2 流动相的选择

参照相关文献[10-12]，试验比较了甲醇-水、甲醇-0.5%磷酸溶液和甲醇-2%醋酸溶液3种流动相分别进行试验考察，结果以甲醇-0.5%磷酸为流动相，峰型更尖锐，分离度更好，理论塔板数更高。同时为了使所测物质的色谱峰分离度更好，出峰时间更合理，采用梯度洗脱的方法。通过对甲醇和0.5%磷酸溶液的比例进行调节和优化，使得所测5种活性成分均峰形良好，保留时间适宜，不受杂质峰的影响，见图2。

3.3 供试品溶液制备方法的考察

首先先用甲醇对药材进行了提取，发现色谱峰杂质比较多，故用乙醚对极性小的成分进行提取，

分离。提取后的药渣再以甲醇、80%甲醇溶液和50%甲醇溶液为溶剂，分别采取超声 15、30、45 min提取方法处理样品，比较发现5种成分在80%甲醇溶液中均较稳定，提取效果好，杂质干扰少。而采用80%甲醇溶液超声15 min已经将样品中的5种活性成分提取完全，且节约时间，操作简便。使用本法测定的结果准确，重复性好，基线平稳，可有效地控制养肝解毒丸的质量。