复方银杏叶制剂中总银杏酸含量测定方法的优化△

郑云枫，阚宏飞，杨阳，严辉，潘苏华，郭海英

（南京中医药大学，江苏 南京 210023）

银杏叶制剂中残留银杏酸（ginkgolic acid，GA）的问题一直受到国内外学者的关注[1]，它被认为是银杏叶提取物（EGb）及制剂中的主要有害物质，可引起肝损伤、免疫毒性、胚胎毒性及严重的过敏反应[2-3]。为了保障银杏叶制剂使用的安全性，所有EGb及其制剂必须建立相应的银杏酸检测方法，并严格限定其含量[4-5]。

图1 银杏酸结构式

目前，已报道的银杏酸定量分析法有分光光度法[6]，RP-HPLC[7]，GC-MS[8]及 HPLC-ESI-MS[9]等，其中RP-HPLC被公认为是最成熟的一种检测方法。但由于银杏酸为一系列的弱极性化合物，包括白果新酸（GA1），白果酸（GA2），十七烷二烯银杏酸（GA3），氢化白果酸（GA4）以及十七烷一烯银杏酸（GA5）五种主要成分，且在EGb及其制剂中的含量很低，因此样品溶液制备能否将总银杏酸提取完全并达到定量检测的要求，是银杏酸HPLC含量测定的关键。从已报道的文献看，总银杏酸测定法中样品制备方法各不相同，如赵月珍等[10]采用甲醇回流-氯仿萃取法制备银杏叶及制剂样品溶液；田紫平等[11]采用石油醚提取法对银杏叶中银杏总酚酸进行制备；仰榴青等[12]采用正己烷提取-硅胶柱色谱法对银杏叶总酚酸进行了制备处理；而何静仁[13]在银杏叶中总酚酸测定时采用了甲醇提取-正己烷萃取法，这些不同的样品处理方法必然会影响EGb或制剂中银杏酸含量测定的准确性。

复方银杏叶胶囊是由刺梨（Rosa roxbughii Tratt）与EGb组成的复方银杏叶制剂[14]，两者配伍可以减轻EGb引起的消化道不良反应，提高银杏叶制剂的用药安全[15]。本研究拟以复方银杏叶制剂为对象，首先考察了几种常用的银杏酸提取制备方法，在此基础上采用响应面曲线法进一步优化了样品制备过程中提取溶剂类型、溶剂用量、提取时间等参数，旨在建立准确、灵敏的总银杏酸分析方法，为EGb及其制剂中银杏酸的准确分析提供参考。

1 仪器与材料

Waters 2695高效液相色谱系统（Alliance 2695四元泵，PDA二极管阵列检测器），Empower色谱工作站；BT-220S电子天平（赛多利斯）；KQ-100DB型数显超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；离心机（TGL-16G，上海安亭科学仪器厂）；1810-D型自动双重纯水蒸馏器（上海申生科技有限公司）。白果新酸对照品（纯度大于 98%，批号：111690-201403），由中国食品药品检定研究院提供，供含量测定用；总银杏酸对照品（批号：111594-201304），由中国食品药品检定研究院提供，供定位用。复方银杏叶胶囊（中试产品，自制，批号：150101）。甲醇、乙腈均为色谱纯；水为娃哈哈饮用纯净水；乙醇、正己烷、石油醚、正己烷、冰醋酸均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hedera ODS-2（150 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇-3%HAC水溶液（92∶8）；检测波长：310 nm；柱温：30℃；流速：1 mL·min－1。

2.2 对照品溶液的制备

取白果新酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含5.2μg的溶液，作为对照品溶液；另取总银杏酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含105μg的溶液，作为定位用对照溶液。

2.3 线性关系考察

精密称取白果新酸对照品适量，加甲醇制成浓度为33.20μg·mL－1标准贮备溶液，再依次稀释成16.60、8.40、4.20、2.10、1.05μg·mL－1的系列对照品溶液，按上述色谱条件测定峰面积值，以对照品浓度X（μg·mL－1）为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为Y＝20 849X－1669.9，r＝0.999 8，结果表明白果新酸在1.05～16.60μg·mL－1呈良好的线性关系。

2.4 检测限和定量限

以白果新酸测定检测限和定量限。结果显示检测限（信噪比3∶1）：检出浓度为 0.35μg·mL－1；定量限（信噪比为10∶l）为1.05μg·mL－1。以该浓度的白果新酸对照品连续进样5次，RSD为2.28%。

2.5 不同样品溶液制备方式对制剂中总银杏酸测定的影响

2.5.1 石油醚提取-甲醇溶解 精密称取复方银杏叶胶囊内容物5.0 g，置圆底烧瓶中，加入石油醚（60～90℃）100 mL，称定重量，回流提取2 h，放冷，补足失重，过滤，精密吸取续滤液50 mL，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，并定容至2 mL，0.45μm微孔滤膜过滤，即得[11]。

2.5.2 甲醇提取-氯仿萃取 精密称取复方银杏叶胶囊内容物5.0 g，置圆底烧瓶中，加入甲醇100 mL，称定重量，回流提取2 h，放冷，补足失重，过滤，精密吸取续滤液50 mL，回收溶剂，加水50 mL分散溶解并转移到分液漏斗中，用氯仿萃取2次，每次50 mL，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇溶解，并定容至2 mL，0.45μm微孔滤膜过滤，即得[10]。

2.5.3 甲醇提取-正己烷萃取 精密称取复方银杏叶胶囊内容物5.0 g，置圆底烧瓶中，加入甲醇100 mL，称定重量，回流提取2 h，放冷，补足失重，过滤，精密吸取续滤液50 mL，置分液漏斗中，用正己烷萃取2次，每次50 mL，合并正己烷液，蒸干，残渣加甲醇溶解，并定容至2 mL，0.45μm微孔滤膜过滤，即得[13]。

2.5.4 测定法 精密吸取样品溶液、对照品溶液及定位对照溶液各20μL，注入液相色谱仪，比较各样品溶液中与总银杏酸对照品相应色谱峰的峰面积，并依据 《中华人民共和国药典》规定方法，以白果新酸对照品外标法计算总银杏酸含量[16]。见表1及图2。

结果显示，在此色谱条件下总银杏酸类成分分离度较好，三种银杏酸制备方法对复方银杏叶胶囊中总银杏酸的含量检测结果影响较大，以石油醚提取-甲醇溶解法制备的样品中，仅能检测到GA1及GA2，以白果新酸计算该样品总银杏酸的含量最低，仅有0.933 mg·kg－1；而以甲醇提取-正己烷萃取法的提取率最高，能够检测到与总银杏酸对照品溶液中GA1～GA5的5个色谱峰，其总银杏酸含量为2.847 mg·kg－1，明显高于采用甲醇提取-氯仿萃取法制备的样品中检测的含量，提示以甲醇提取结合正己烷萃取法更适宜于复方银杏叶胶囊中总银杏酸的前处理。

表1 不同样品溶液制备方法对制剂中总银杏酸测定结果影响

图2 复方银杏叶胶囊中银杏酸HPLC图

2.6 响应面曲线法优化总银杏酸制备方法

为了进一步优化提取方法，依据2.5.3项下制备方法，在预试验及参考文献基础上[17]，选择甲醇浓度（A）、溶剂体积（B）及提取时间（C）为3个主要考察因素，以总银杏酸（GA1～GA5）含量作为考察指标，得到各因素影响趋势及范围，进而采用Box-Behnken法优化总银杏酸供试品液提取制备方法。根据Box-Behnken中心组合设计原理，依据单因素预试实验结果，各因素设置3水平进行试验，用－1，0，1表示，共计15个试验点。因素水平表见表2，结果见表2。

表2 试验设计因素与水平表

表3 响应面实验设计及结果

表中NO.1～12为析因试验，NO.13～15为中心验证实验。运用Design-Expert 8.0.5软件对各组测定计算的总银杏酸含量进行分析，进行二次回归拟合，得到针对甲醇浓度（A）、溶剂体积（B）及提取时间（C）的多元回归方程，如下：Y＝2.94＋0.12A＋0.055B＋0.014C－0.064AB－0.039AC－0.005 043BC－0.13A2－0.17B2－0.16C2。

对拟合的模型进行方差分析，结果见下表。本实验选用的模型P＜0.000 1，具有高度显著性；而失拟误差项（P＝0.096 8）不显著，说明该回归模型与实验情况模拟较好，误差较小。此外模型的相关系数R2＝0.969 1，也表明该模型的拟合程度较好，可用于总银杏酸提取条件的预测和优化分析。由回归系数的显著性水平可知，A（P＜0.000 1），B（P＜0.000 1），AB（P＝0.000 1），AC（P＝0.002 3）极显著，其它项均不显著。根据Box-Behnken拟合模型，显示甲醇浓度对总银杏酸的提取效果具有较大影响，提取溶剂体积影响其次，提取时间的影响并不明显。

表4 回归模型方差分析结果

2.7 响应面分析与优化

采用Design-Expert 8.0.5软件，依据回归方程绘制不同影响因素对总银杏酸含量的三维曲线图，响应面分析图形可较直观地反映各自变量及其交互作用对响应值的影响，见图3。从图中可以看出，提取体积固定时，总银杏酸测得量随着甲醇浓度的升高先增高后趋于平稳；甲醇浓度一定时，评价结果随提取体积的增加先升高后降低；提取时间固定时，总银杏酸测得量随着甲醇浓度的升高先增高，后趋于平稳；甲醇浓度一定时，评价结果随提取时间的增加先升高后亦趋于平稳。在交互作用分析中，AB（P＝0.000 1）及 AC（P＝0.002 3）均小于0.01，表明甲醇浓度和提取溶剂体积、甲醇浓度和提取时间两组因素间的交互作用显著；而BC的P值均大于0.05，显示提取溶剂体积和提取时间之间的交互作用不显著。

图3 提取过程甲醇浓度、溶剂体积、提取时间交互作用及其对总银杏酸含量影响的响应曲面

根据Design-Expert 8.0.5优化所得总银杏酸样品溶液制备方法：采用85%甲醇，提取体积为98.76 mL，提取时间为1.8 h，在此条件下预测总银杏酸测定量可达到2.952 mg·kg－1。考虑到提取过程中实际情况，最终研究样品溶液制备方法：精密称取复方银杏叶胶囊内容物5.0 g，置圆底烧瓶中，加入85%甲醇100 mL，称定重量，回流提取1.8 h，放冷，补足失重，过滤，精密吸取续滤液50 mL，置分液漏斗中，用正己烷萃取2次，每次50 mL，合并正己烷液，蒸干，残渣加甲醇溶解，并定容至2 mL，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。为了验证响应面分析法所得结果的可靠性，以优化得到的条件对复方银杏叶样品进行3次验证试验，结果显示，总银杏酸测得的平均含量为2.916 mg·kg－1，与预测值相对偏差1.21%，说明确定的制备方法稳定可行。

3 讨论

银杏酸类成分极性较小，在银杏叶提取物中的含量较低，且除银杏酸外银杏叶提取物中还有弱极性的黄酮类、聚戊烯醇类等成分，因此EGb及其制剂一般需要预处理后才能进行HPLC分析。本研究中曾参考2015版 《中华人民共和国药典》银杏叶提取物项下制备方法[16]，采用甲醇超声提取后进行检测，但由于制剂中银杏酸含量较低，以甲醇∶样品（5∶1）进行提取，进样量为20μL时仍无法检测到样品中的银杏酸类成分，提示该方法作为银杏叶制剂中银杏酸限度检测方法并不适宜。

在研究过程中还发现，以正己烷、石油醚为溶剂提取时，容易造成本品粉末在溶剂中团聚成小块，从而影响银杏酸的提取效果，这可能也是造成石油醚提取-甲醇溶解法提取不完全的原因；此外还尝试过采用硅胶柱色谱法对样品进行处理，但检测出的总银杏酸含量相对偏低，推测这与硅胶对银杏酸产生了一定死吸附有关。

针对优化后的测定方法进行了方法学的考察。取同一复方银杏叶胶囊样品5份，依法制备样品，HPLC测定。结果显示，复方银杏叶胶囊中总银杏酸含量测定的精密度RSD为1.42%，其中银杏酸GA1、GA 2及GA 5的RSD＜3.0%，而银杏酸 GA3及GA 4的RSD相对较大，分别达4.67%、5.38%，这可能是与它们在总银杏酸中的相对百分含量较低（＜5%）有关。在已知含量的复方银杏叶样品中，分别加入不同量银杏酸对照品进行加样回收试验，进行加样回收率试验，测得该方法的平均回收率为97.7%，RSD为2.25%（n＝6）。表明以上样品溶液的提取和纯化方法具有较好的回收率，建立的含量测定方法稳定、可行，这可为含银杏叶提取物制剂中银杏酸限量检查提供参考。