柘木多酚和氧化白藜芦醇的制备与其抗氧化活性研究△

赵建萍，陈倩，曹俊东，唐崇明，李雅丽，刘江云*

（1.上海城建职业学院健康与社会关怀学院，上海 201415；2.苏州大学医学部药学院中药系，江苏 苏州 215123；3.常州技师学院，江苏 常州 213000；4.云南省第一人民医院药学部，云南 昆明 650032；5.新疆医科大学第一附属医院VIP内科，新疆 乌鲁木齐 830011）

柘木为桑科柘属植物柘树Cudrania tricuspidata（Carr.）Bur或构棘 Cudrania cochinchinensis（Lour.）Kudo et Masam.去皮后的干燥根或藤茎。柘木是我国传统中药材，始载于宋代 《嘉佑本草》，其性味甘温无毒，功能清热凉血、舒筋活络，主治妇人“崩中血结，疟疾”、咯血、腰腿疼痛以及跌打损伤等症。柘树又名柘，柘桑，其根（穿破石）、树皮或根皮（柘木白皮）、茎叶、果实亦供药用[1-2]。现有柘木糖浆、柘木颗粒等中成药，临床用于胃肠道肿瘤患者化疗或放疗的辅助治疗。现代化学成分研究资料表明，柘木中主要含有丰富的 酮、异戊烯基黄酮、黄酮醇、异黄酮等黄酮类成分[3-5]，此外还含有生物碱、香豆素、白藜芦醇、三萜[6]、多糖[7]等多种成分[1]。柘木中的这些成分具有抗氧化[8]、抗肿瘤[9]、酪氨酸酶抑制[10-11]、消炎镇痛等多种药理活性[1]。柘木在药品、食品添加剂、美容美白产品等方面具有开发价值，近年来逐渐受到学者关注。本实验对柘木总多酚的制备工艺及其抗氧化活性进行研究，为阐释柘木药效物质基础和进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 柘木茎（批次20130510）药材购自安徽安国药材市场，经苏州大学药学院陆叶博士鉴定为桑科植物柘树Cudrania tricuspidata（Carr.）Bur.的干燥藤茎。

1.1.2 试剂 氧化白藜芦醇（纯度97.2%）、芦丁（纯度94.5%）对照品由本实验室自制，经NMR、UV数据进行鉴定，其纯度采用液相峰面积归一法计算；DPPH（1，1’-二苯基-2-三硝基苯肼）和 ABTS（2，2’-二氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）购自日本东京化成工业株式会社。AB-8、LX2000大孔吸附树脂（西安蓝晓科技有限公司）；ODS填料（75 mm，日本Cosmosil公司）；乙腈（色谱纯，美国 Fisher公司）；色谱用纯净水（杭州娃哈哈公司）；过硫酸钾、乙醇、甲醇等试剂（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

1.1.3 仪器 岛津LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；ODS色谱柱（5C18-AR-Ⅱ，4.6 mm×250 mm，日本Cosmosil公司）；AvanceⅢplus 500 MHz核磁共振仪（德国Bruker Daltonics公司）；UV-SPD-M20A紫外分光光度计（日本岛津公司）；ME215S型电子天平（德国Starorious公司）。

1.2 方法

1.2.1 柘木多酚的提取分离 称取干燥柘木茎药材1 kg，砸碎，用8 L 75%乙醇浸泡过夜，加热回流提取1.5 h，药渣再用8 L 75%乙醇加热回流1 h，两次提取液合并，减压浓缩至无醇味，加水稀释至2 L（每1 mL相当于0.5 g生药材），即得提取液CTE。CTE上AB-8大孔树脂柱（10 cm×100 cm，柱体积BV 800 mL），依次用水（5 L）、50%乙醇（4 L）、70%乙醇（4 L）洗脱（2 BV·h－1），分别收集洗脱液，减压浓缩，干燥，分别得到相应柘木多酚样品CTP-1（7.46 g）、CTP-2（5.32 g）。

1.2.2 氧化白藜芦醇的分离 取CTP-1样品0.24 g，加甲醇20 mL超声溶解，加水稀释至40 mL，上LX2000树脂柱（2.5 cm×50 cm，柱体积BV 100 mL），依次用30%、50%、70%、95%甲醇各200 mL洗脱（2 BV·h－1）。经HPLC检识，取30%甲醇水洗脱流分，浓缩，上C18反相柱（2.5 cm×50 cm，柱体积BV 100 mL），依次用25%、28%、31%、34%、37%甲醇各200 mL洗脱（2 BV·h－1）。34%甲醇洗脱流分经HPLC检识为单体，经浓缩干燥，得到化合物1（51 mg；氧化白藜芦醇）。采用 UV、1H-NMR和13C-NMR等波谱技术，参考相关文献，对化合物1进行结构鉴定。

1.2.3 液相分析 参考相关文献[12-14]并适当优化，采用HPLC方法检测柘木多酚和其中的氧化白藜芦醇成分含量。液相分析条件：流动相为乙腈（A）-0.2%乙酸水溶液（B），梯度洗脱（0～15 min，10%A；15～18 min，10%～15%A；18～40 min，15%A；0～65 min，15% ～35%A）；检测波长290 nm；柱温30oC；流速1.0 mL·min－1；进样量20μL。采用峰面积（Y）和样品浓度（X，mg·mL－1）进行含量计算，氧化白藜芦醇的线性方程为Y＝1.732×108X＋1.372×106（r＝0.999 8），在0.020 18～0.403 6 mg·mL－1范围内线性关系良好。

1.2.4 抗氧化活性测试 DPPH法参考课题组前期文献方法[15]进行。取配好的0.04%DPPH乙醇溶液3 mL中加入800μL各浓度的样品溶液，室温避光反应30 min后用分光光度计测定517 nm处吸光度Ai。芦丁作对照。按公式（1）计算各样品对DPPH自由基的清除率。ABTS法参考文献方法[15]进行。将生成的ABTS溶液用乙醇稀释，使其在30℃、734 nm波长下的吸光度为0.70±0.05，即得到ABTS工作液。在试管中加入100μL的样品溶液，再加入3.0 mL的ABTS工作液混匀，放置于暗处反应6 min，在734 nm处测吸光值为Ai。ABTS自由基清除率的计算公式同公式（1）。

上式中Ai为加入样品反应后溶液的吸光值，Ab为未加样品的DPPH工作液的吸光度值。根据清除率数据曲线计算半数清除率（IC50）。

2 结果

2.1 柘木多酚的制备

采用乙醇提取和AB-8大孔吸附树脂纯化方法，制备获得柘木多酚 CTP-1和 CTP-2。CTP-1再经LX2000树脂和ODS色谱柱进一步分离，纯化获得化合物1。

化合物1：黄色粉末状固体，易溶于甲醇、乙醇等。UV（MeOH）λmax：230，290 nm。1H-NMR（500 MHz，C3D6O）：δ8.55（1 H，br s，OH-2），8.37（1 H，br s，OH-4），8.15（2 H，br s，OH-3′，5′），7.40（1 H，d，J＝8.5 Hz，H-6），7.33（1 H，d，J＝16.4 Hz，H-a），6.88（1 H，d，J＝16.4 Hz，H-b），6.52（each 1 H，d，J＝2.1 Hz，H-2′，H-6′），6.43（1 H，d，J＝2.1 Hz，H-3），6.38（1 H，dd，J＝8.5，2.1 Hz，H-5），6.23（1 H，dd，J＝2.1，2.1 Hz，H-4′）。13C-NMR（125 MHz，C3D6O）：δ158.6（C-4），158.6（C-3′），158.2（C-5′），156.0（C-2），140.7（C-1′）， 127.3（C-b），125.3（C-a），123.4（C-1），116.4（C-6），107.5（C-2′），104.6（C-3），104.5（C-4′），102.7（C-5），101.2（C-6′）。以上数据与文献报道的氧化白藜芦醇NMR数据[16-17]对照一致，鉴定为氧化白藜芦醇。见图1。

图1 氧化白藜芦醇结构

采用液相分析，测定柘木多酚CTP-1、CTP-2中主要成分氧化白藜芦醇的含量分别为21.25%、19.87%。其液相色谱见图2。

图2 柘木多酚CTP-1、柘木多酚CTP-2的HPLC图

2.2 抗氧化测试

采用DPPH、ABTS两种自由基清除率分析方法，以芦丁作为对照品，对柘木多酚CTP-1、CTP-2以及氧化白藜芦醇的抗氧化活性进行测定。各样品对DPPH自由基的清除率见表1，可见测试样品对该自由基具有很强清除率，并呈量效依赖关系。根据清除率随样品溶液浓度变化的数据，计算出CTP-1、CTP-2、氧化白藜芦醇及芦丁对该自由基的IC50分别为 19.12±0.37、25.31±0.05、11.20±0.13、9.74±1.98μg·mL-1。

各样品对ABTS自由基的清除率见表2。可见测试样品对该自由基具有较强清除率，并呈量效依赖关系；其抗氧化活性均强于对照品芦丁。根据清除率随样品溶液浓度变化的数据，计算出 CTP-1、CTP-2、氧化白藜芦醇及芦丁对照品对该自由基的IC50分别为 49.32±0.68、60.13±2.02、29.70±0.73、181.6±0.64μg·mL-1。

表1 不同浓度柘木多酚样品对DPPH自由基清除率

表2 不同浓度柘木多酚样品对ABTS自由基清除率

3 结论

柘木中主要成分为多酚类化合物。本文采用大孔吸附树脂法，对柘木多酚的制备工艺进行了研究，并对其中主要成分进行分离和鉴定。分离鉴定和HPLC检测结果表明，柘木多酚中的主要成分为氧化白藜芦醇。文献报道柘木中存在白藜芦醇和氧化白藜芦醇类成分，但其主要含有槲皮素、二氢桑色素、山柰素等黄酮及其苷类成分[2，13-14]。本文首次发现，柘木中含有高含量的氧化白藜芦醇，与已有文献有较大差别，推测这可能是由于白藜芦醇类成分是强氧化剂，容易在长时间加热提取、浓缩、分离过程中氧化变性有关[18]。采用大孔树脂分段制备，结合小孔树脂、反相硅胶进行分离，具有分离效率高、实验操作条件温和的优点，并可有效避免样品长期高温浓缩过程中失活、硅胶色谱柱吸附严重等缺陷。液相色谱图中可见，柘木多酚中还含有复杂的多种多酚类组分色谱峰，推测为文献报道的其它黄酮类成分[1，3-5]。

进一步的抗氧化活性测试结果表明，两种柘木多酚对DPPH、ABTS两种自由基均具有强抑制作用，这显然与其中含有的高含量氧化白藜芦醇有关，同时柘木中的其它多种复杂组分（图1）也对其抗氧化作用有所贡献。白藜芦醇类成分是公认有益的优良抗氧化剂[8，18-20]，柘木中富含氧化白藜芦醇，可作为优良的抗氧化剂进行开发，应用于食品添加剂、美白化妆品等领域。