肾舒颗粒(无糖型)质量标准研究

陈海滨

(福建省药品检验所,福建 福州 350001)

肾舒颗粒(无糖型)质量标准研究

陈海滨

(福建省药品检验所,福建 福州 350001)

目的：建立肾舒颗粒的质量标准。方法：用TLC对处方中白花蛇舌草、大青叶、甘草、黄柏进行定性鉴别；用HPLC测定黄柏中盐酸小檗碱的含量。结果：定性鉴别分离度好，专属性强。含量测定盐酸小檗碱在0.01～1.28μg具有良好的线性关系,r=0.999 9。结论：该方法简便、准确，重复性好，可用于肾舒颗粒(无糖型)的质量控制。

肾舒颗粒；白花蛇舌草；大青叶；甘草；黄柏；盐酸小檗碱

肾舒颗粒由白花蛇舌草、大青叶、瞿麦、萹蓄、海金沙藤、淡竹叶、地黄、黄柏、茯苓、甘草等10味中药组成。具有清热解毒，利水通淋功能，用于尿道炎，膀胱炎，急慢性肾盂肾炎。肾舒颗粒全国共有4个生产批准文号，3家企业生产，原标准收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂》第9册(标准编号：WS3-B-1752-94),仅有两个化学鉴别项。本次研究购得两个企业、不同批号的无糖型样品多批，力争用同一标准更好控制同一成药质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

日本岛津LC-2010CHT高效液相色谱仪，包括真空脱气机，四元梯度泵，自动进样器，二极管阵列检测器，LC Solution工作站，Milli-QA 超纯水器(Millipore)。

1.2 试药

肾舒颗粒(无糖型)(厦门中药厂，批号080401，080402，080501；四川迪康科技药业股份有限公司成都迪康制药公司，批号071003，071004，071101)；缺白花蛇舌草、缺大青叶、缺甘草、缺黄柏的阴性对照品(厦门中药厂)。

白花蛇舌草对照药材(批号121183-200402)，甘草对照药材(批号120904-200512)，关黄柏对照药材(批号120937-200506)，黄柏对照药材(批号121510-200703)，齐墩果酸对照品(批号110709-200505)，靛玉红对照品(批号0717-9402)，盐酸小檗碱对照品(批号110713-200609)，均购自中国药品生物制品检定所。乙腈为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 薄层色谱鉴别

2.1 白花蛇舌草、甘草薄层鉴别

取本品10g，加甲醇80mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL、盐酸1mL，超声使溶解，置水浴上加热回流1h，取出，冷却，用二氯甲烷振摇提取2次(25mL/次)，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取白花蛇舌草、甘草对照药材各1g，分别加甲醇25mL，同法制备，残渣分别加甲醇2mL使溶解，作为对照药材溶液。另取齐墩果酸对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。取缺白花蛇舌草、缺甘草两种阴性肾舒颗粒样品，同供试品溶液提取方法制成阴性对照品溶液。吸取供试品溶液4～8μL，对照品及对照药材溶液各4μL，分别点于同一羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G预制薄层板上，使成条状，以甲苯-醋酸乙酯-醋酸(48∶16∶2)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与甘草对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的条斑；置紫外灯(365nm)下检视，在与齐墩果酸对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光条斑，见图1。

A.日光 B.紫外光灯(365nm)1.缺甘草肾舒颗粒(无糖型)阴性对照品 2.甘草对照药材(批号120904-200512) 3～5.肾舒颗粒(无糖型)(批号080401，080402，080501) 6～8.肾舒颗粒(无糖型)(批号071003，071004，071101) 9.缺白花蛇舌草肾舒颗粒(无糖型)阴性对照品 10.白花蛇舌草对照药材(批号121183-200402) 11.齐墩果酸对照品(批号110709-200505)图1 肾舒颗粒中白花蛇舌草、甘草薄层色谱鉴别

2.2 大青叶薄层鉴别

取本品20g，研细，加甲醇80mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水30mL，超声使溶解，用二氯甲烷振摇提取2次(25mL/次)，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取靛玉红对照品，加二氯甲烷制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。再取缺大青叶的肾舒颗粒样品，同供试品溶液提取方法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述3种溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-二氯甲烷-丙酮(5∶4∶1)为展开剂，展开，展距约5cm，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图2。

1.靛玉红对照品(批号0717-9402) 2.缺大青叶肾舒颗粒(无糖型)阴性对照品 3～5.肾舒颗粒(无糖型)(批号080401，080402，080501) 6～8.肾舒颗粒(无糖型)(批号071003，071004，071101)图2 肾舒颗粒中靛玉红薄层色谱鉴别

2.3 黄柏薄层鉴别

分别取关黄柏、黄柏对照药材各0.5g，加甲醇10mL，加热回流15min，滤过，滤液作为对照药材溶液。另取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。再取缺黄柏的肾舒颗粒样品，同供试品溶液提取方法，制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)试验，吸取对照品及对照药材溶液各2μL，阴性对照品及“2.2项下”的供试品溶液1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，分别以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，见图3。

1～3.肾舒颗粒(无糖型)(批号071003，071004，071101) 4～6.肾舒颗粒(无糖型)(批号080401，080402，080501) 7.缺黄柏肾舒颗粒(无糖型)阴性对照品 8.关黄柏对照药材(批号120937-200506) 9.黄柏对照药材(批号121510-200703) 10.盐酸小檗碱对照品(批号110713-200610)图3 肾舒颗粒中黄柏薄层色谱鉴别

3 含量测定

3.1 色谱条件和测定方法

采用Welch Materirals XB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；以0.033mol·L-1的磷酸二氢钾溶液-乙腈(72∶28)为流动相；柱温：35℃；流速：1.0mL·min-1，测定波长：265nm；进样量(自动进样)：供试品溶液20μL，对照品溶液10μL。

3.2供试品溶液制备

取研细的样品0.3g，精密称定，精密加入流动相25mL，称重，超声提取20min(功率300W，频率40kHZ)，放冷至室温，用流动相补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

3.3 对照品溶液制备

取经105℃干燥5h的盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加流动相配制成每1mL约含0.01mg的溶液，即得。

3.4 线性关系考察

精密称取105℃干燥5h的盐酸小檗碱对照品适量，加流动相溶解，制成对照品母液(0.128 1mg·mL-1)，分别精密吸取0.4，2，5，10，25，50mL，置50mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。精密吸取10μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积与对照品进样量(μg)进行回归，得线性方程Y=4 434 060.30X-16 312.44(r=0.999 9)，线性范围为0.01～1.28μg。

3.5 专属性试验

取缺黄柏阴性样品0.3g，按供试品溶液的制备方法制得阴性样品溶液，测定，结果见图4，缺黄柏肾舒颗粒(无糖型)阴性对照品溶液在与对照品相应的保留时间处无峰出现，表明方中其他各味药材不干扰盐酸小檗碱的测定。

A.盐酸小檗碱对照品 B.肾舒颗粒(无糖型)样品(批号080401) C.缺黄柏肾舒颗粒(无糖型)阴性对照品图4 盐酸小檗碱对照品、肾舒颗粒(无糖型)及缺黄柏阴性样品HPLC图

3.6重复性试验

取肾舒颗粒(无糖型)样品(批号080401)，按供试品溶液提取方法平行制备6份，依上述色谱条件进行测定并计算盐酸小檗碱的含量，平均含量为3.94mg/袋，RSD=1.89%(n=6)。

3.7 耐用性试验

3.7.1 稳定性试验 取供试品溶液在0，4，8，12，16，20，24h后按上述色谱条件测定样品中盐酸小檗碱峰面积，结果RSD=0.40%。

3.7.2 在一定范围内改变流动相比例对色谱图的影响 选用Welch Materirals XB-C18色谱柱试验，分别采用流动相乙腈-0.033mol·L-1磷酸二氢钾溶液(26∶74)、(28∶72)、(30∶70)，结果盐酸小檗碱峰与相邻的杂质峰均能达到良好的分离，见图5。

3.7.3 不同品牌色谱柱对实验的影响 选用Welch Materirals XB-C18色谱柱，SHIMUDZU岛津柱子，对同一份供试品溶液，按上述色谱条件进行含量测定，结果样品与对照品均获得良好的峰形，见图6，盐酸小檗碱平均含量为0.37mg·g-1，RSD=1.68%。

3.7.4 不同仪器对实验的影响 选用同一色谱柱Welch Materirals XB-C18色谱柱，对同一份供试品溶液，分别在岛津2010CHT高效液相，Agilent 1100液相，按正文色谱条件进行含量测定，结果样品与对照品均获得良好的峰形，见图7，平均含量0.38mg· g-1，RSD=1.36%。

图5 不同比例流动相的HPLC图A.乙腈-0.033 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(26∶74) B.乙腈-0.033 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(28∶72) C.乙腈-0.033 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(30∶70)

A.Welch Materirals XB-C18 B.SHIMUDZU岛津柱子图6 不同品牌色谱柱HPLC图

A.岛津2010 CHT B.Agilent 1100图7 同一品牌色谱柱不同仪器HPLC图

3.8 加样回收率试验

取已知含量(0.392mg·g-1,3.94mg/袋)的肾舒颗粒(无糖型)样品(批号080401)9份，每份约0.15g，采用加样回收，分别精密加入盐酸小檗碱对照品溶液(0.012 6mg·mL-1)4,5,6mL，按供试品溶液方法，每个梯度平行制备3份，测定，结果见表1。

表1 盐酸小檗碱加样回收率试验

3.9 样品含量测定

取6批样品按上述色谱条件，测定盐酸小檗碱含量，结果见表2。

表2 肾舒颗粒(无糖型)盐酸小檗碱的含量测定 mg/袋(mg·g-1)

4 讨论

4.1 薄层色谱鉴别

2.1项下白花蛇舌草薄层色谱鉴别中，厦门中药厂生产的肾舒颗粒(无糖型)斑点颜色明显比四川迪康科技药业股份有限公司成都迪康制药公司的清晰，通过对二者制法的比较，估计与两药厂醇沉密度不同所致，该步骤有可能使两家药厂所生产出的肾舒颗粒在含量上有所不同。

黄柏、关黄柏薄层的鉴别中，黄柏为常用皮类药材，有关黄柏与川黄柏之分，近来研究发现，黄柏与关黄柏不仅其主要有效成分小檗碱含量有明显差异，而且辅助成分黄柏碱等也存在较大差异[1-3]，为确证处方所用为关黄柏还是川黄柏，采用中国药品生物制品检定所提供的两个对照药材进行试验，同时具有大小相近的盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的两个黄色荧光斑点的是关黄柏；只有盐酸小檗碱的黄色荧光斑点，或虽然有盐酸巴马汀黄色荧光斑点，但极小或隐约可见的是黄柏[4]。在同一张薄层板上，相同取样量的黄柏与关黄柏的盐酸小檗的黄色荧光斑点，前者明显比后者大而且亮[5]，结果两个生产企业所用均为川黄柏。

白花蛇舌草为处方中君药，在【含量测定】指标成分选择中曾拟对其进行含量测定的考察。查阅大量参考文献[6-9]，白花蛇舌草中含豆甾醇、谷甾醇、熊果酸、齐墩果酸、香豆酸等成分。国外报道其中还含有蒽醌类、环烯醚萜类成分。仅熊果酸、齐墩果酸有中国药品生物制品检定所提供对照品。因此对该两种成分进行含量测定摸索。先用薄层法进行预试，供试品溶液未经过酸水解时，四川迪康科技药业股份有限公司成都迪康制药公司的样品未能检出齐墩果酸、熊果酸，只有经过酸水解后，两个生产企业样品可检出齐墩果酸。但考虑该两个成分非白花蛇舌草独有成分，在中药材中非特征性成分，且需酸水解后测定，缺乏一定的专属性，故只对该药材进行薄层色谱鉴别。

4.2 流动相选择

采用《中国药典》黄柏药材[10]液相条件：乙腈-0.1%磷酸溶液(50∶50)，结果盐酸小檗碱峰与杂质峰分离较差。用HPLC测定盐酸小檗碱含量所用的流动相有多种[11-15]，摸索用乙腈-0.05mol·L-1磷酸二氢钾、乙腈-0.05mol·L-1磷酸二氢钾(43∶57)(每1 000mL中加入十二烷基磺酸钠1.7g)，0.033mol·L-1的磷酸二氢钾溶液-乙腈(60∶40)，乙腈-磷酸二氢钠(0.025mol·L-1)-十二烷基硫酸钠(0.025mol·L-1)(50∶25∶25)，乙腈-水(每 100mL加 0.26mL磷酸、0.5mL三乙胺与0.05g十二烷基硫酸钠)(46∶54)等5种流动相，结果选用0.033mol· L-1的磷酸二氢钾溶液-乙腈(60∶40)，系统适用性较好，且配制简便。

4.3 盐酸小檗碱转移率

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StudyonQualitySpecificationofShenshuGranule

Chen Haibin

(Fujianinstitutefordrugcontrol，FuzhouFujian350001,China)

Objective:To establish the quality standard for Shenshu Granule.Methods:HedyotisdiffusaWilld.,IsatisindigoticaFort.,Glycyrrhiza,PhellodendronchinenseSchneid. in Shenshu Keli were identified by TLC. The content ofPhellodendronchinenseSchneid.was determined by HPLC.Results: The study showed that the dentification by TLC was distinct and highly specific. The linear range of berberine hydrochloride was 0.01～1.28μg(r=0.999 9).Conclusion: The method for identification was simple, accurate, realizable and reproducible. It can be used for quality control of Shenshu Keli.

Shenshu Granule；HedyotisdiffusaWilld.；IsatisindigoticaFort.；Glycyrrhiza；PhellodendronchinenseSchneid.；Berberine Hydrochloride

*陈海滨，E-mail：chenhaibin1997@126.com

2010-03-24)