梧州茶厂六堡散茶真菌分离与鉴定

周梦珍，欧惠算，邱瑞瑾，龙志荣，张灵枝*

（1.华南农业大学园艺学院，广东广州 510642；2.广东省粤东技师学院，广东汕头 515041；3.梧州市六堡茶研究院，广西梧州 543000；4.梧州市茶产业发展办公室，广西梧州 543000）

六堡茶是广西特有的历史名茶，是经渥堆、蒸压、晾置、陈化等工艺制成的后发酵茶，属于黑茶类[1]。随着黑茶的发展，黑茶的安全问题受到广泛关注，对黑茶中微生物的研究成为热点，同时也推动了对六堡茶中微生物的研究。温志杰等[2]分析了六堡茶渥堆过程中微生物种群的变化，检测到该过程中有大量的细菌、酵母、霉菌；欧惠算等[3]发现六堡茶汽蒸后有酵母、青霉和曲霉等微生物存在；陈庆金等[4]用Miseq测序分析在属上对六堡茶陈化初期微生物进行鉴别，结果表明六堡茶陈化初期微生物以曲霉属、散囊属为主。目前对六堡茶陈化后期微生物的研究较少，陈化是六堡茶品质形成的关键工序，且六堡茶耐于久藏，越陈越香[5]。有研究表明，六堡茶在陈化过程中主要生化成分含量及香气物质含量均发生一定的变化，经过适当时间贮存的六堡茶，其品质得到提高和纯化，六堡茶的饮用价值也得到了提高[6-7]。研究选取梧州茶厂六堡散茶进行优势真菌的分离鉴定，对六堡茶陈化中后期过程中微生物与品质关系的机理进行初探，从而改进六堡茶的陈化工艺，为提高产品质量提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

六堡茶茶样来自广西梧州茶厂，分别陈放2年、4年、6年、8年的特级六堡茶散茶。

分离培养基：PDA培养基、20%蔗糖查氏琼脂培养基；纯化鉴定培养基：PDA培养基、20%蔗糖查氏琼脂培养基、改良的20%蔗糖查氏琼脂培养基（加入2%的六堡茶毛茶茶汤）。

1.2 实验方法

1.2.1 茶样中真菌的分离纯化

菌悬液的制备：分别称量2年、4年、6年、8年的茶样各10 g，用剪刀将茶梗、茶叶剪碎，放入250 mL的锥形瓶中，量取90 mL无菌蒸馏水，加入锥形瓶中。将锥形瓶置于振荡器上震荡15 min，制成10-1倍的菌悬液。在无菌的超净工作台上用移液枪吸取1 mL的菌悬液置于另一支装有9 mL的无菌水试管中，充分混匀，得到10-2倍的稀释液菌悬液，依次类推，至得到10-6倍的稀释菌悬液。

菌的分离培养：用移液枪分别取1 mL的10-2～10-6的稀释菌悬液置于平板培养基上，然后用无菌的三角玻璃棒划“十”和“（）”，每个浓度各进行3次重复，再取2组1 mL无菌水置于平板培养基上，用无菌的三角玻璃棒均匀涂布，作为对照试验。将实验组和对照组的平板培养基放到30°C的培养箱内恒温培养7 d。

菌纯化：根据各菌种在分离培养基上的生长情况，为各菌挑选适合其生长的培养基。用挑种针挑取少量菌丝，采用划线法再进行多次分离纯化培养得到纯种菌株并编号，接着用15 mL大试管斜面培养，于冰箱内4°C环境下保存菌种。

1.2.2 菌株的形态学观察

将保存的菌种取出，置于30°C恒温培养箱中活化培养24 h后，用三点接种法将菌种接到适宜的纯化鉴定平板培养基上，倒置于30°C恒温培养箱中培养7 d，取出拍照并观察菌落的颜色、质地、有无渗出液等菌落特征。菌株显微镜观察：用插片法观察，将无菌的盖玻片大约倾斜45°左右插入PDA培养基、20%蔗糖查氏培养基和改良的20%蔗糖查氏培养基中。待菌丝长到盖玻片上，取出盖玻片置于载玻片上在光学显微镜下观察并拍照。

1.2.3 菌株的DNA序列分析

用平板划线法对菌株进行培养7 d后，送往上海生工技术有限公司，提取基因组DNA，应用引物ITS1和ITS4扩增真菌核糖体RNA基因的转录间隔区 （ITS），测定序列，将得到的序列在NCBI中使用Blastn软件进行核酸-核酸的同源序列比对，取相似度97%及以上的前几个序列作为鉴定参考序列。用MEGA 6.06软件构建供试菌与参考菌的系统发育树，选用邻接法 （Neighborjoining，NJ），用自展（Bootstrap）做验证进化树分析，随机自检率设置为1000，其余保持默认设置。

2 结果与分析

2.1 菌株的形态鉴定

在选取的4种梧州茶厂六堡散茶中，分离纯化后得到9种真菌，其形态特征如表1所示。

表1 菌株的形态特征及初步鉴定Table 1 Morphological characteristics and preliminary identification of fungal strains

续表

图1 wz1-2菌株的菌落形态特征和显微结构Fig.1 Morphological characteristics and microstructure of wz1-2 strain

图2 wz4-2菌株的菌落形态特征和显微结构Fig.2 Morphological characteristics and microstructure of wz4-2 strain

图3 wz2-3菌株的菌落形态特征和显微结构Fig.3 Morphological characteristics and microstructure of wz2-3 strain

图4 wz4-3菌株的菌落形态特征和显微结构Fig.4 Morphological characteristics and microstructure of wz4-3 strain

图5 HUQ2菌株的菌落形态特征和显微结构Fig.5 Morphological characteristics and microstructure of HUQ2 strain

图6 wz2-2菌株的形态特征和显微结构Fig.6 Morphological characteristics and microstructure of wz2-2 strain

图7 wz2-1B菌株的菌落形态特征和显微结构Fig.7 Morphological characteristics and microstructure of wz2-1B strain

图8 jinhua4菌株的菌落形态特征和显微结构Fig.8 Morphological characteristics and microstructure of jinhua4 strain

图9 jinhua6菌株的形态特征和显微结构Fig.9 Morphological characteristics and microstructure of jinhua6 strain

2.2 菌株的分子鉴定

将六堡茶中分离出的9种真菌进行DNA序列分析，分子鉴定的结果如表2所示，菌株wz2-3、wz4-3 和菌株 wz2-1、wz4-2、HUQ2、wz2-2、wz2-1B、jinhua4、jinhua6 的 ITS 序列系统发育树（NJ）分别如图10、图11所示。

表2 六堡茶中真菌的分子鉴定Table 2 Molecular identification of fungal species isolated from Liupao Loose Tea

图10 菌株（wz2-3、wz4-3）ITS序列的系统发育树（NJ）Fig.10 Phylogenetic tree of fungal ITS sequences of strains wz2-3 and wz4-3

图11 菌株（wz1-2、wz4-2、HUQ2、wz2-2、wz2-1B、jinhua4、jinhua6）ITS 序列的系统发育树（NJ）Fig.11 Phylogenetic tree of fungal ITS sequences of strains wz1-2， wz4-2， HUQ2， wz2-2， wz2-1B，jinhua4 and jinhua6

2.3 鉴定最终结果

研究结合形态学鉴定与分子学鉴定的方法，最终将六堡茶中分离出的9种真菌鉴定为：Penicillium sclerotiorum （菌核青霉）、Penicillium jiangxiense（江西青霉）、Aspergillus amstelodami（阿姆斯特丹曲霉，Eurotium amstelodam （阿姆斯特丹散囊菌）的异名[11]）、Aspergillus ruber（赤曲霉，Eurotium rubrum（赤散囊菌）的异名[11]）、Aspergillus versicolor（杂色曲霉变种）、Cladosporium oryzae（稻枝 孢 ）、Cladosporium asperulation、Cladosporium cladosporioides （枝状枝孢）、Pseudocercospora fici（无花果假尾孢）。

3 讨论

菌株进行形态鉴定时，对培养条件要求非常严格，培养基种类、培养时间、培养温度的不同，都会使菌落形态特征产生差异，而且对于某些同源性较高的菌株，其形态特征非常相似，以形态学的表征去鉴定菌株容易误判[13]。ITS全新标记具有快速、准确和高效特异性的特点，现广泛用于真菌属种的鉴别[14-15]。研究采取分子手段结合传统形态学特征对菌株进行鉴定，使鉴定结果更加可靠。

胡治远等[16]从18个不同品种茯砖茶中分离出主要优势真菌为冠突散囊菌，并从贮藏30年的老茯砖茶中分离出冠突散囊菌、谢瓦式曲霉、蜡叶散囊菌、阿姆斯特丹散囊菌、肋状散囊菌。普洱茶贮藏时的主要优势真菌是黑曲霉和青霉属真菌，还有少量其他种属真菌[17-19]。六堡茶贮藏时主要优势真菌为曲霉属、散囊属和青霉属的真菌，还有酵母属真菌[4，20-21]。研究从六堡散茶中分离出的主要优势真菌是曲霉属、散囊菌属真菌，还有青霉属、枝孢属、假尾孢属真菌等腐生真菌，这些真菌均为环境常见真菌，未发现特殊的真菌和致病菌。

研究表明阿姆斯特丹散囊菌是茶叶中的金花菌[16，22-24]。“金花”菌对黑茶品质的形成有重要的作用，能够分泌淀粉酶和氧化酶，将茶叶中的淀粉水解为单糖，将多酚类物质氧化成一系列氧化产物，从而消除了茶叶粗老气味，降低茶叶苦涩味，使茶汤呈红棕色，滋味更加醇和[25-27]。

枝孢属和假尾孢属真菌是植物病原菌，分布广泛，可以从土壤、空气及各种有机质中分离得到[10-12]。李小容[28]对茶树叶面真菌与内生真菌进行分离鉴定，发现鲜叶表面上有Cladosporium cladosporioides。普洱茶发酵和贮藏中也有Cladosporium cladosporioides[29-30]。目前对枝孢属和假尾孢属的研究较少，有待进一步研究枝孢属和假尾孢属是否会产生潜在毒素。