大叶苦丁茶多糖的研究进展

张现珠，王潇潇 ，陈贵杰，谢旻皓，曾晓雄 *

（1.南京财经大学食品科学与工程学院/粮食流通与安全协同创新中心，江苏南京 210023；2.南京农业大学食品科技学院，江苏南京 210095）

苦丁茶也称“茶丁”“富丁茶”“皋卢茶”，是我国传统的药食两用代茶植物饮品， 有着悠久的饮用历史，具有重要的药用和保健价值。早至东汉时期，苦丁茶就已经被广泛饮用。《本草纲目》记载苦丁茶能止渴、明目、除烦、消痰、利水、利咽[1]。 关于制作苦丁茶源植物的说法不一， 目前市场上流通的主流苦丁茶商品是由来于冬青科（Aquifoliaceae）冬青属（Ilex）植物的“大叶苦丁茶”和木犀科（Oleaceae）女贞属（Ligustrum）的“小叶苦丁茶”[2]。 大叶苦丁茶即冬青科苦丁茶是接受度最高、流通最广的苦丁茶，冬青科苦丁茶包含苦丁茶冬青 （Ilex kudingcha C.J. Tseng， 也称扣树 I.kaushue S. Y. Hu）、大叶冬青（I. latifolia Thunb）以及枸骨（I. cornuta Lindl）等[3-4]，其中苦丁茶冬青（I.kudingcha）是海南和两广地区的主要品种，而大叶冬青（I. latifolia）主要分布在华东和湖北等地[2]。

苦丁茶传统上用于治疗热病、解毒、脱水和腹痛等[4]。 许多研究表明，饮用大叶苦丁茶能增强机体的抗氧化能力，还具有预防高脂血症、护肝以及保护心脏等作用[5-7]。 大叶苦丁茶提取物具有保护心血管健康、修复DNA、抗焦虑、抗炎症、缓解糖尿病和神经保护等功能活性[8]。大叶苦丁茶富含皂苷、黄酮、多酚、挥发油以及多糖等有效成分[9]，其微量元素锌、锰、铜、镁元素也明显高于其他茶叶[10]。近年来， 人们主要专注于大叶苦丁茶中多酚和三萜等活性成分的研究， 大叶苦丁茶多糖的相关研究报道较少。 大叶苦丁茶多糖由阿拉伯糖、 甘露糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和果糖等组成[11]，其结构多样、毒性低、副作用少[12-13]，是一种极具开发价值的生物活性物质。

文章对大叶苦丁茶多糖的提取、分离纯化、结构分析以及生物活性等方面展开综述， 为进一步挖掘大叶苦丁茶多糖的潜在价值和大叶苦丁茶多糖的开发利用提供一定的科学依据和理论基础。特别说明的是，由于马黛茶（Mate）的源植物巴拉圭冬青（I. paraguariensis）与大叶苦丁茶同为冬青属（Ilex）植物，亲缘关系相近，且成分组成非常相似，文章部分章节也将其一并讨论。

1 大叶苦丁茶多糖的提取

水浸提法是提取大叶苦丁茶多糖的常用方法，水能快速的透过苦丁茶组织，使大叶苦丁茶中的多糖溶于水中[11]。 以热水浸泡大叶苦丁茶更能加快水分子的运动， 既加快苦丁茶多糖的溶解速度，也增加了苦丁茶溶出物的含量。大叶苦丁茶多糖的提取工艺流程大致如下： 烘干→粉碎→过筛→热水浸提→醇沉→干燥→粗多糖。 表1 列出了大叶苦丁茶提取的部分典型例子。

表1 苦丁茶粗多糖的提取Table 1 Extraction of crude polysaccharides from Kudingcha

综合上表可知，热水浸提-乙醇沉淀是提取大叶苦丁茶多糖最主要的方法。 不同提取工艺提取的苦丁茶粗多糖提取率在0.65%~8.14%之间，可能有多种原因导致了提取率的差异。 多糖提取量随着液料比和提取温度的增加而增加， 但液料比增到一定的程度后多糖提取量下降。 液料比增大使多糖的浓度差低，易于从细胞中溶出，温度的升高加速分子的扩散解附作用， 从而增加多糖的浸出率，但是液料比过大不仅不能增加多糖提取量，而且还使浓缩样品的负担更大。 多糖提取量随着温度的升高而增加， 温度的升高能够提高多糖的析出速率和得率，但温度过高含糖量会下降，温度过高会破坏多糖结构，得率降低。苦丁茶粗多糖提取率相差较大也与所选择的原料有一定关系。 黄敏桃等[23]对比了不同产地的苦丁茶多糖含量发现，广西产的苦丁茶多糖含量高于广东和海南。大叶苦丁茶置放的时间越久， 其成分会有所改变，其多糖含量也会明显减少， 多糖的提取量也相应减少[17]。 另外，测定方法也会对提取得率的计算结果产生影响。测定多糖含量通常采用苯酚-硫酸法比色法，该法步骤简单、灵敏度高、显色稳定、重现性好、回收率高、结果准确，但各自的报道中，对反应温度的控制、试剂中苯酚及硫酸用量、反应时间不尽相同[16]。

传统的热水浸方法具有溶剂易得、 条件简单、操作简便以及危险系数较小等优点，但是该方法具有浸提次数多、提取时间长、提取率较低等缺点。时代的不断进步推动着多糖提取技术的不断发展和完善，提取技术从最初的简单溶剂提取法向更先进的仪器提取法以及多种技术融合的方式发展，研究者们也尝试将超临界CO2流体萃取技术等新型提取工艺应用到大叶苦丁茶多糖的提取中[22]。 例如，韦晓洁等[22]采用超临界CO2流体萃取技术提取苦丁茶多糖，以正交实验优化了萃取温度、萃取压力、萃取时间、夹带剂以及夹带剂剂量等影响茶多糖得率的参数，在最优萃取条件下苦丁茶多糖的提取率达到7.05%，较传统提取工艺而言，提取时间明显减少，提取率明显增高[22]。 超临界CO2流体萃取具有提取温度低、萃取率高、萃取周期短、低耗以及污染小等优点，适用于苦丁茶多糖的提取。 相较于传统的提取方法，超临界CO2流体萃取能够在低温下萃取苦丁茶多糖并能够最大限度保留多糖的生物活性。 随着多糖研究的进一步深入，更多更先进的提取方法将会不断被探究，寻求一种高效、节能、低成本、高提取率的大叶苦丁茶多糖提取方法是未来大叶苦丁茶多糖研究的方向之一。

2 大叶苦丁茶多糖的分级纯化

大叶苦丁茶多糖提取液中往往会含有蛋白质、色素、脂类、无机盐等杂质，这些非多糖组分的存在会对苦丁茶多糖后期的定性分析、含量测定、分子量测定以及结构表征等造成干扰， 也可能对苦丁茶多糖的生物活性产生一定的影响。 因此在苦丁茶多糖分离纯化的过程中需要将这些杂质去除，目前常常采用乙醇沉淀、透析、Sevag 法脱蛋白等方式纯化粗多糖（见表1）。

大叶苦丁茶多糖作为生物大分子化学结构复杂，为研究其化学结构和生物活性，研究者们采用多种纯化方法以得到性质相对统一的苦丁茶多糖组分。 多糖分离纯化的方法包含分级沉淀、 盐析法、金属络合物法、季铵盐沉淀法、制备区域电泳法、超滤法、色谱法等[24]。 目前应用范围最广泛的多糖纯化方法为色谱法，包括离子交换色谱法、凝胶柱色谱法等， 使混合物中各多糖组分尽可能的彼此区分开。 表2 列出了大叶苦丁茶多糖组分的分离纯化的相关报道。

表2 大叶苦丁茶多糖的分级纯化Table 2 Fractional purification of Kudingcha polysaccharides

续表

从表2 可知大叶苦丁茶多糖的分离纯化与其他植物多糖的纯化方式一致， 使用阴离子交换层析配合乙醇分级沉淀和凝胶层析的方法得到相对均一的多糖组分， 一般可以从大叶苦丁茶粗多糖中分离得到2~4 个多糖组分，包括中性多糖和酸性多糖。大叶苦丁茶多糖的差异性与蛋白质含量密切相关。 多糖中的蛋白质含量不仅有利于多糖的生物活性， 也可作为多糖质量的一个指标性因子。 因此脱蛋白是一项很重要的步骤。 Sevag 法一次只能除去少量蛋白质，需多次重复进行方能达到满意效果。与Sevag 法相比，DEAE-52 纤维素在分离大叶苦丁茶多糖的同时具有脱色、脱蛋白的作用，分离组分中的蛋白质含量急剧下降，具有较高的纯化效果。

3 大叶苦丁茶多糖的结构特征

多糖的活性和功能与其结构密切相关，大叶苦丁茶多糖的结构表征是阐明其功能机制的必要条件， 也是大叶苦丁茶多糖开发利用的科学基础。 研究者们常常联合使用高效液相色谱仪（HPLC）、气相色谱仪（GC）、傅里叶转化-红外光谱仪（FT-IR）以及质谱仪（MS）、核磁共振波谱仪（NMR）等仪器解析大叶苦丁茶多糖的化学结构[31]。

大叶苦丁茶多糖经过酸水解产生的单糖，经衍生化之后可以采用HPLC、GC-MS 或GC 进行定性和定量分析， 也可以不经过衍生化的步骤利用离子色谱进行分析。 表3 列举了近年来大叶苦丁茶多糖的单糖组成的相关研究和结果。 表3 中IKPS，SP，ILPS，IKTP，SPI，ILP50-2 为大叶苦丁茶多糖在不同文献中的缩写。

表3 大叶苦丁茶多糖的单糖组成Table 3 Monosaccharide composition of Kudingcha polysaccharides

续表

由于大叶苦丁茶源植物的物种、品种、产地、提取部位等差异， 不同的大叶苦丁茶多糖的单糖组成各不相同，可以看出阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、半乳糖醛酸（GalA）、鼠李糖（Rha）、甘露糖（Man）、葡萄糖醛酸（GlcA）、果糖（Fru）和少量木糖（Xyl）、岩藻糖（Fuc）以及核糖（Rib） 是大叶苦丁茶多糖的主要单糖组分。 Ara、Gal、GalA、Glc 和 Rha 几乎出现在所有报道的大叶苦丁茶多糖当中， 特别是Ara 和Gal 含量在大叶苦丁茶多糖中占据了较大比重。

除了单糖组成， 研究者在分析表征大叶苦丁茶多糖结构时还借助甲基化分析、FT-IR 以及NMR 等表征了大叶苦丁茶多糖的精细结构。 SHI等[35]通过傅里叶转化-红外光谱对大叶冬青（I.latifolia）多糖ILP50-2 的结构进行了分析，出现了3386、2933 和 1429 cm-1的特殊峰值， 结果表明其中含有O-H 基团，甲基、亚甲基基团，C-O-C、CO-H 基团，通过GC-MS 的进一步分析得该种多糖是由11 种部分甲基化的糖醇乙酸酯组成，包含11种不同糖苷键相连接的残基，并通过NMR 解析了大叶冬青（I. latifolia）多糖ILP50-2 的精细结构，表明其为 α-L-Araf-（1→， →3）-α-L-Araf-（1→，→5）-α-L-Araf-（1→， →3，5）-α-L-Araf-（1→，→2）-α-L-Rhap-（1→， →2，4）-α-L-Rhap-（1→，β-D-Galp-（1→， →4）-β-D-Galp-（1→， →4）-β-D-Glcp-（1→， →6）-α-D-Manp-（1→， and →3，6）-α-D-Galp-（1→的重复结构 （图 1）。 MENG等[29]用紫外光谱分析分离纯化所得的大叶苦丁多糖 IAPS-1 在 260 到 280 nm 处没有特殊的吸收峰，表明其中蛋白质和核酸杂质所占比例较少；通过FT-IR 分析得其中含有 O-H、C-H、C-O 基团。通过NMR 分析得该种多糖主要是吡喃葡萄糖基间通过α-1，6 糖苷键连接而成且存在→4）-α-LRhap-（1→、→3-α-D-Galp-（1→以及重复的→4）-α-Glup-（1→结构。 KUNGEL 等[36]在紫外光谱260~280 nm 处分析得马黛茶多糖中几乎不含蛋白质、多肽、酚类物质，通过FT-IR 测得其含有C=O、C-H、C-O、C-OH 基团，这与所报导的大叶苦丁茶多糖的结构相一致。 ZHAI 等[33]通过FT-IR 分析从苦丁茶中提取的IKTP，和前面所得结果一致都含有 C=O、C-H、C-O、C-OH 基团。 FAN 等[19]通过傅里叶红外光谱分析在分离纯化所得的苦丁茶多糖中发现了新的基团S=O， 推测该种苦丁茶多糖为硫酸多糖。 MARIA-FERREIRA 等[32]通过 NMR 和甲基化分析发现，巴拉圭冬青（I. paraguariensis）多糖主要是阿拉伯半乳聚糖（Arabinogalactan），包含β-（1→4）-糖苷键连接的吡喃型半乳糖 （Galp）主链，其O-6 位上连接Ara 糖基单元，这些阿拉伯半乳聚糖也可能与Ⅰ型鼠李半乳糖醛酸聚糖（Rhamnogalacturonan）通过 O-4-Rha 单元相连接。DARTORA 等[34]利用甲基化分析、1D 和 2D NMR技术解析了巴拉圭冬青（I. paraguariensis）多糖SPI组分的精细结构，表明它是一种鼠李半乳糖醛酸聚糖，主链结构为→4）-6-OMe-α-D-GalpA-（1→，主链间插入了鼠李糖基（α-l-Rhap），Rha 糖基上还连有阿拉伯半乳聚糖（图2）。

图1 大叶冬青（I. latifolia）多糖ILP50-2 组分的化学结构Fig.1 Chemical structure of I. latifolia polysaccharide ILP50-2

图2 I. paraguariensis 多糖SPI 组分的结构Fig.2 Chemical structure of I. paraguariensis polysaccharide SPI

另外，研究者们还利用刚果红（Congo-red）试验、扫描电子显微镜（SEM）等技术探究了苦丁茶多糖的空间构象和高级结构。例如，SHI 等[35]发现大叶苦丁茶多糖ILP50-2 组分在溶液中不具有三股螺旋构象，团聚态的ILP50-2 表现出枝状不规则网状微观结构和不均匀表面，表面呈无定形结构。

4 大叶苦丁茶多糖的生物活性

4.1 抗氧化作用

近年来， 人们对多糖及复合物的抗氧化活性作用有了越来越深入的认识。已有大量研究指出，从植物中提取分离得到的多糖类化合物具有清除羟基自由基、 活性氧自由基以及二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基等作用。大叶苦丁茶粗多糖具有较强的体外抗氧化活性， 且其抗氧化活性与多糖浓度之间存在良好的量效关系[37]。 FAN 等[19]发现大叶冬青的粗多糖ILPS， 以及经DEAE-52 纤维素色谱分离得到的 ILPS-1、ILPS-2、ILPS-3 和ILPS-4 四个组分， 均具有较强的DPPH 自由基清除能力、OH 清除能力、O2-清除能力和Fe2+螯合能力。KUNGEL 等[36]研究发现大叶苦丁冬青多糖的抗氧化活性与其具有的大量-OH、-COOH 和C=O 以及含糖醛酸等官能团有关，并且其水溶性、三重螺旋立体构型和较高的分支度也可能有利于抗氧化活性。 有研究发现Glc 含量越高的多糖其抗氧化活性越强[38]，糖醛酸含量越高的多糖其抗氧化作用越明显[39-40]。 FAN 等[19]研究发现，大叶冬青苦丁茶多糖清除活性氧自由基的能力随糖醛酸含量升高及分子量增加呈明显上升趋势。 多糖清除超氧阴离子的机制可能与O-H 键的离解能和给电子取代基的加入有关。 虽然多糖清除羟自由基的机制尚不清楚， 但有人提出多糖可以抑制羟自由基的形成，这可能是由于提取氢或电子的机制[45]。 此外， 已证实糖醛酸含量和平均分子量对清除羟基自由基有显著作用[41]。

在体外大叶苦丁茶多糖2 mg/mL 浓度时清除DPPH 自由基能力达到 72%[37]，0.5 mg/mL 浓度时即显示出较强清除羟自由基的能力[42]，0.6 mg/mL浓度时抑制H2O2对红细胞溶血的作用与0.2 mg/mL 的VC 相近[20]。粗多糖ILPS 表现出最强的清除活性， 其清除活性随着样品浓度的增加而明显增加，范围从 62.5~1000 μg/mL。 ILPS 粗品的清除活性的 IC50分别为 118.1±3.3 μg/mL[19]。目前，关于大叶苦丁茶多糖的体内抗氧化机制尚未有报道。

4.2 抑菌作用

大叶苦丁茶样品的抗菌活性与活性成分含量呈一定的相关性。 大叶苦丁茶多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌具有一定的抑菌作用[37]，抑菌机制可能为破坏微生物的细胞壁与细胞膜， 引起形态改变导致细菌自溶而产生抗菌作用[43]。林雄平等[44]研究大叶苦丁茶水溶性多糖对大肠杆菌、 变形杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、桔青霉、黑曲霉7 种常见的食品腐败菌的抗菌效果，结果表明大叶苦丁茶多糖提取物的抗细菌活性比其抗真菌活性强， 且对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为5 mg/mL。 多糖的抑菌机理大致可以分为3 种，即阻止有害菌进入细胞、破坏有害菌的细胞膜与细胞壁、影响有害菌的基因表达[43]。 大叶苦丁茶多糖具有一定的抗菌作用， 但其抗菌的作用机制还有待更深入研究。

4.3 降血糖作用

目前糖尿病的治疗主要依靠注射胰岛素、口服磺酰脲类和双胍类降血糖药物， 长期服用降糖药会对人体产生较大的副作用， 还会导致胰岛素依赖，因此从天然产物中筛选降血糖药物，是开发糖尿病药物的一条可行途径。 于淑池等[45]利用不同因素诱发的高血糖模型小鼠研究了大叶苦丁茶多糖对四氧嘧啶、肾上腺素、葡萄糖等诱发的高血糖的降血糖作用， 结果发现大叶苦丁茶多糖能较好地降低糖尿病小鼠血糖水平， 且表现出一定的量效关系，但高剂量苦丁茶多糖组（300 mg/kg·d）稍低于降糖药盐酸二甲双胍（125 mg/kg·d）组的治疗水平。 四氧嘧啶对胰岛β 细胞具有特异性毒性作用，通过产生超氧自由基破坏β 细胞，对胰岛β 细胞具有特异性毒性作用， 导致胰岛素分泌减少，造成实验性糖尿病。大叶苦丁茶多糖的摄入可有效降低四氧嘧啶造成的糖尿病小鼠的血糖水平[45]，它可能是通过清除超氧自由基来减少β 细胞的损伤从而降低血糖水平。

4.4 免疫调节作用

大叶苦丁茶中的活性成分不仅能激活T、B 淋巴细胞、巨噬细胞、细胞毒性T 细胞以及淋巴因子激活的杀伤细胞等免疫细胞， 还能促进IL-1、IL-2、IFN-γ 等细胞因子的分泌，活化补体等[42]。 多糖还能增强巨噬细胞的其他功能， 如释放活性氧（ROS）和 NO[46]、分泌促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）等。 HU 等[42]研究发现大叶苦丁茶多糖可能是通过上调巨噬细胞内 TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS mRNA 的表达，抑制 NF-κB 信号通路中 p-p65 蛋白的正常表达，上调MAPKs 信号通路中p-ERK、p-JNK、p-p38 蛋白的表达，进而促进 NO、TNF-α、IL-6 等免疫活性因子的分泌，以活化巨噬细胞参与进行复杂的机体免疫活动， 从而起到免疫的作用。SHI 等[35]发现大叶苦丁茶多糖ILP50-2 组分能够增强巨噬细胞的吞噬作用并提高了NO 以及TNF-α、IL-6 和 IL-1β 等细胞因子的释放，也通过斑马鱼模型证实了它能够增加ROS 和NO 释放的活性，具有免疫调节作用。

4.5 肝保护作用

大叶苦丁茶多糖还具有对急性和慢性肝损伤的保护作用。 FAN 等[19]研究发现，给小鼠饲喂100和200 mg/kg 的大叶苦丁茶多糖14 d， 能够显著降低四氯化碳诱导的急性肝损伤。 相比肝损伤模型组， 大叶苦丁茶多糖处理能够降低血清中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的活性，提高肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性，并降低丙二醛（MDA）的含量。200 mg/kg 的大叶苦丁茶多糖的肝保护效果接近甚至超过护肝药水飞蓟素。 ZHAI 等[33]给小鼠饲喂 200、400 和 800 mg/kg 大叶苦丁茶多糖 8 周，能够显著减轻高果糖摄入引起的肝脏损伤。 大叶苦丁茶多糖能够降低血清中AST 和ALT 的活性以及总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、指血栓素A2 和内皮素-1 的水平， 同时提高肝脏中SOD 和GSH-Px 活性并降低MDA 的含量。

5 展望

大叶苦丁茶作为一种传统中药材， 相对于名贵药材而言资源更丰富， 其叶子中的多糖含量高于其他部位，老叶中更多[47]。 在提取利用苦丁茶三萜类、皂甙及多酚等功能成分的同时，开发、利用其多糖资源具有良好的前景。目前，国内外对苦丁茶多糖的研究还不够系统， 对多糖的理化性质研究方面还停留在热稳定性和化学性质上， 对结构表征的研究局限于一级结构，对构-效关系的研究并未涉及。 对苦丁茶多糖活性的研究局限于抗氧化、降血糖、免疫调节等少量方面，且大多采用体外实验，整体或体内实验研究报道较少。特别值得注意的是， 关于苦丁茶多糖作用机制的研究几乎没有，目前的资料难以系统、准确地反应苦丁茶多糖活性的全貌。 这对进一步的药效学和药理学研究，以及识别潜在的作用位点存在较大阻碍，也限制了苦丁茶多糖相关产品的开发与研究。另外，焦安妮[48]在研究开发大叶苦丁茶多糖的纳米制剂精深加工产品，给新产品的开发提供了一个新思路。朱科学等[49]研究苦丁茶多糖流变学特性，发现溶液的表观粘度随着浓度的增加而升高，表现出“非牛顿流体”特性以及“凝胶体”特性，具有良好的抗降解性能，可用于制作凝胶。研究结果为大叶苦丁茶多糖在食品工业中的应用提供一定的理论支持。未来，需继续加深大叶苦丁茶多糖的结构以及生物学活性和作用机制的研究， 并加大开发利用力度，将其应用于食品、医药、化工等领域。