茶氨酸复合剂对酒精性肝损伤大鼠肝脏保护作用研究

李大伟 张士康* 吴惠岭朱跃进 施海根 宋燕华 张海华

（1.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016；2.浙江省疾病预防控制中心，浙江杭州 310051）

茶氨酸复合剂对酒精性肝损伤大鼠肝脏保护作用研究

李大伟1张士康1*吴惠岭2朱跃进1施海根1宋燕华2张海华1

（1.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016；2.浙江省疾病预防控制中心，浙江杭州 310051）

研究茶氨酸复合剂对酒精性肝损伤大鼠肝脏的保护作用。采用小剂量50%乙醇每日1次灌胃1个月建立大鼠慢性酒精肝损伤(AIL)模型；正常大鼠作为空白组；除正常组外，其余各组以等体积50%乙醇每日1次灌胃1个月；对照组以市售海王星辰(HWXC)1.5g/kg，茶氨酸复合剂低、中、高剂量组分别为0.1、0.2、0.4g/kg的剂量灌胃，1次/d，连续1个月；以大鼠血液ALT、AST、TG和肝脏病理检查为主要衡量指标，观察其对肝脏的保护作用。结果显示茶氨酸复合剂各组与模型组相比大鼠血液ALT、AST、TG含量显著降低，病理检查HE染色显示肝内脂变显著减轻，表明茶氨酸复合剂对酒精性肝损伤大鼠的肝脏具有保护作用。

茶氨酸复合剂 酒精性肝损伤大鼠 保护作用

肝脏是酒精代谢的主要场所，饮酒后，乙醇在胃及小肠上段吸收入血，约98%乙醇在肝脏内代谢，若长期过量饮酒，使乙醇在体内不能及时代谢而蓄积，可对肝脏造成不同程度的损伤[1,2]。从组织学分析，酒对肝器官的损伤可表现为肝脏水肿、肝脂肪化以及不同程度的肝纤维化改变等；从生化指标的变化看，可有标志肝细胞线粒体损伤的谷草转氨酶(AST)升高、标志肝细胞膜损伤的谷丙转氨酶(ALT)升高、标志肝脏脂肪代谢紊乱的甘油三酯(TG)水平升高等[3]。

茶氨酸复合剂为中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院研制的以茶氨酸、茶多酚、γ-氨基丁酸、支链氨基酸等为主要功效成分配方的复合氨基酸制剂[4]。前期研究表明[5]，茶氨酸复合剂可改善肝组织的自由基代谢，减轻肝脏氧化损伤，但对肝功能以及肝组织病理形态的影响尚未作进一步研究。本文的研究，旨在通过观察茶氨酸复合剂对酒精性肝损伤大鼠血清 AST、ALT、TG、CHOL、HDL以及肝组织病理形态的影响，探讨茶氨酸复合剂是否通过降低AST、ALT、TG等指标及改善肝组织病理形态，从而维护肝功能，以进一步阐明茶氨酸复合剂对酒精性肝损伤大鼠肝脏的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂、仪器

试验动物：健康SD大鼠，清洁级，雄性，体重170～190g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2008-0016。动物饲料由浙江省实验动物中心提供，执行标准GB 14924.1-2001。

茶氨酸复合剂 (自制，其中L-茶氨酸含量1.5mg/mL)，使用时以30℃蒸馏水溶解；海王金樽片(每片1.0g，深圳海王健康科技发展有限公司)；无水乙醇(分析纯)、多聚甲醛(色谱纯)、盐酸(分析纯，杭州华东医药股份有限公司)；ALT试剂盒、AST试剂盒、TG试剂盒、HE染色试剂盒 (南京建成生物工程有限公司)。

3-15K高速冷冻离心机，Sigma公司；恒温水浴DK-S26，上海精宏实验设备有限公司；电子分析天平，梅特勒-托利多(上海)科技有限公司；UV-2102型紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；TBA-40FR全自动生化分析仪，日本东芝。LEICA-RM2135型切片机，德国LEICA公司；VANOX AHB-LB型万能显微镜，日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、给药及取材

清洁级SD大鼠60只，随机分成6组，即正常组、模型组、海王金樽组(对照组)、茶氨酸复合剂低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组大鼠10只，雄性。模型组、海王金樽组、茶氨酸复合剂低剂量组、中剂量组和高剂量组每头大鼠分别按7g/kg BW剂量，以50%酒精于每日晨一次灌胃给予；除模型组单纯酒精灌胃外，对照组在酒精灌胃同时，每天给予海王金樽片的供试液15mL/kg BW(折合海王牌金樽片的剂量为1.5g/kg BW)。低、中、高剂量组每天分别以0.1、0.2、0.4g/kg BW的剂量灌胃给予茶氨酸复合剂水溶液；正常组每日仅给予以同样剂量生理盐水灌胃一次。动物每3天称重1次，按体重调整各给药组灌胃量，实验时间为30d。实验结束时，低、中、高剂量组、模型组及海王金樽组一次灌胃给予50%乙醇14mL/kg BW(折合乙醇的剂量为7g/kg BW)，禁食16h处死大鼠取血，立即3500r/min离心5min，取血清。测定血清ALT(丙氨酸氨基转移酶)、AST(天门冬氨酸氨基转移酶)、TG(甘油三酯)、CHOL(胆固醇)、HDL(高密度脂蛋白)；剥离大鼠肝脏称重，以10%甲醛固定待检。

1.2.2 指标检测

a.ALT、AST、TG、CHOL、HDL指标检测参考试剂盒说明书进行。

b.肝脏病理组织学变化、诊断标准和结果判定：

实验材料：从肝左叶中部做横切面取材，固定于10%中性甲醛溶液作常规石蜡包埋切片(4μm厚)，HE 染色。

镜检：从肝脏的一端视野开始记录细胞的病理变化，用40倍物镜连续观察整个组织切片。主要观察脂滴在肝脏的分布、范围和面积。

c.评分标准[6,7]

表1 肝脏病理评分标准Table1 Liver pathology score

1.2.3 统计方法

采用统计软件SPSS15.0进行数据处理，统计方法采用方差分析、秩和检验。

2 结果

2.1 对大鼠体重的影响

茶氨酸复合剂各受试组结果见表2，实验数据符合方差齐性要求。实验各时间点茶氨酸复合剂各剂量组、对照组(海王金樽)、模型组大鼠体重和空白组比较差异均无显著性(P＞0.05)。

表2 大鼠体重结果(n＝10,±S)Table2 Body weight of rats results

表2 大鼠体重结果(n＝10,±S)Table2 Body weight of rats results

组别Group实验前体重(g)BW before experiment实验后体重(g)BW after experiment 1周1st week 2周3周2nd week 3rd week 4周4th week总增重(g)Total weight gain正常组Normal低剂量组Low-dose中剂量组Middle-dose高剂量组High-dose对照组Control模型组Model P 176.5±8.2 174.1±5.0 173.8±6.2 173.6±8.2 173.7±6.9 177.3±7.3 0.749 213.3±7.4 213.5±6.7 203.8±9.5 208.9±11.4 207.4±11.9 210.0±19.7 0.455 265.4±10.0 266.2±14.7 257.5±16.9 265.6±20.1 249.5±19.6 267.7±17.1 0.130 297.6±12.6 299.1±22.9 292.2±21.8 308.0±24.0 285.1±17.1 318.6±22.9 0.065 329.2±14.7 321.4±29.6 321.5±28.5 340.9±30.9 313.5±19.7 343.8±28.7 0.079 152.7±17.3 147.3±30.6 147.6±28.3 167.4±32.0 139.8±19.0 166.5±26.4 0.125

2.2 茶氨酸复合剂对酒精性肝损伤大鼠血液生化指标的影响

由表3可以看出，与模型组比较：高、中剂量组可显著降低大鼠血清ALT和AST水平 (P＜0.05)；与对照组比较：高、中、低剂量组在降低血清ALT水平方面优于对照组，差异显著 (P＜0.05或P＜0.01)，而高、中剂量组在降低血清AST水平方面优于对照组，差异显著(P＜0.05)。

与模型组、对照组比较：茶氨酸复合剂高剂量组可显著降低血清TG水平，具有显著性差异(P＜0.05)。

茶氨酸复合剂低、中、高三个剂量组血清HDL及CHOL水平与模型组及对照组比较，无显著差异(P＞0.05)。

表3 大鼠血液生化指标检测结果(n＝10,±S)Table3 Test results of blood biochemical parameters in rats

表3 大鼠血液生化指标检测结果(n＝10,±S)Table3 Test results of blood biochemical parameters in rats

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

组别Group正常组Normal模型组Model对照组Control高剂量组High-dose中剂量组Middle-dose低剂量组Low-dose ALT(U/L)39.0±8.7***△△△69.0±32.0 80.5±16.8 50.9±9.43*△△53.8±10.2*△△63.3±19.6△AST(U/L)171.8±36.4*△248.2±45.7 264.8±46.9 185.9±33.9*△203.2±34.2*△258.6±42.6 Blood sugal(mmol/L)6.13±0.69 5.71±0.76 5.53±0.64 6.20±0.88 5.43±0.43 5.94±0.69 TG(mmol/L)0.64±0.11*△△1.23±0.39 1.45±0.24 0.86±0.31*△1.36±0.14 1.30±0.67 CHOL(mmol/L)1.05±0.24*△1.30±0.18 1.31±0.37 1.12±0.22 1.16±0.52 1.10±0.58 HDL(mmol/L)1.81±0.10 2.00±0.14 1.76±0.17 1.96±0.15 1.76±0.26 1.84±0.27

2.3 茶氨酸复合剂对酒精性肝损伤大鼠肝脏病理形态的影响

2.3.1 肉眼观察

正常组大鼠肝色鲜红、边缘锐利、质韧；模型组大鼠肝脏肿大，呈黄褐色，边缘变钝，质地变软，切面油腻；治疗组大鼠的肝脏肿大程度减轻，色泽较红。

2.3.2 HE染色病理形态

茶氨酸复合剂对酒精性肝损伤大鼠肝脏病理组织形态影响的观察结果和肝脏病理评分见表4，显微摄影照片见图1～图6。

由表4、图1～图6分析可知，茶氨酸复合剂高、中、低各剂量组形态学改变与模型、对照组相比均有一定的改善。且高、中剂量组肝脏病理评分较模型组及对照组有显著性差异 (P＜0.05或P＜0.01)。

表4 大鼠肝脏病理组织形态评分(n＝10,±S)Table4 Rat liver pathological morphology score

表4 大鼠肝脏病理组织形态评分(n＝10,±S)Table4 Rat liver pathological morphology score

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

肝脏病理评分Liver pathology score正常组Normal组别Group鼠肝脏病理组织形态描述Morphological description of the rat liver histopathological肝小叶轮廓清晰，肝索放射状排列，肝细胞结构清晰，无变性坏死。核居中，肝窦无明显扩张淤血，汇管区未见炎细胞浸润。0.5±0.7**△△模型组Model对照组Control高剂量组High-dose中剂量组Middle-dose中央静脉周围肝细胞索排列紊乱，小叶界限不清，肝细胞浆中见大小不等较广泛空泡变性，有程度不等的小叶内及门管区灶性炎性细胞浸润，未见纤维间隔形成。 2.0±0.7肝小叶轮廓清晰，肝索放射状排列，部分肝细胞呈中度细胞水肿，部分呈轻度脂肪变性。核居中，部分肝窦表现为扩张淤血，肝小叶及汇管区未见炎细胞浸润，部分肝组织见点状坏死。 1.8±0.5肝小叶轮廓清晰，肝索放射状排列，部分肝细胞呈轻度细胞水肿，核居中，肝窦无明显扩张淤血，肝小叶及汇管区未见炎细胞浸润。形态学较接近正常组。 0.9±0.8**△△肝小叶轮廓清晰，肝索放射状排列，部分肝细胞呈轻度细胞水肿，核居中，部分肝窦表现为扩张淤血，肝小叶及汇管区未见炎细胞浸润。病变较模型组改善明显。 1.3±1.0*△低剂量组Low-dose 1.7±0.5肝细胞索排列稍显紊乱，部分肝细胞呈轻度细胞水肿，核居中，部分肝窦表现为扩张淤血，肝小叶及汇管区未见炎细胞浸润。病变较模型组有所减轻。

图1 正常组（HE，400×）Fig.1 Normal group（HE，400×）

图2 模型组（HE，400×）Fig.2 Model group（HE，400×）

图3 对照组（HE，400×）Fig.3 Control group（HE，400×）

图4 高剂量组（HE，400×）Fig.4 High dose group（HE，400×）

图5 中剂量组（HE，400×）Fig.5 Middle dose group（HE，400×）

图6 低剂量组（HE，400×）Fig.6 Low dose group（HE，400×）

3 讨论

ALT、AST、TG含量升高是肝损伤的两个重要指标。血清中ALT和AST含量升高的程度也反映了肝细胞损伤的程度[8]。肝脏组织细胞的细胞质中含有丰富的ALT，而其他组织中含量很少，因此当肝脏组织细胞受到损伤或者坏死时，ALT从肝脏组织细胞内流出释放入血流，导致了ALT含量的显著升高[9]。肝脏组织细胞中80%的AST集中在线粒体，作为细胞内重要的膜性细胞器，线粒体的膜结构的完善对于细胞正常行使功能至关重要[10]。肝脏组织细胞线粒体膜受损合并细胞膜受损则将导致线粒体内的AST大量释放到血液当中，引起了血清中AST含量的大幅升高。线粒体和细胞膜结构的损伤主要和脂质过氧化有关，乙醇进入细胞后，在氧化的过程中，产生大量自由基，当自由基的量超出系统的抗氧化清除能力时，发生氧化应激反应，氧化细胞膜上的不饱和脂肪酸，最终导致膜结构损伤，致使血清中转氨酶超标，因此ALT和AST是肝脏受到损伤的一个综合指标[11]。而血清中TG含量和脂肪代谢有关，更大程度上反映的是脂质过氧化的水平。本研究显示：酒精性肝损伤模型大鼠的血清ALT、AST活性明显升高，而茶氨酸复合剂高、低剂量组可明显降低血清ALT、AST活性。同时实验还发现，高剂量的茶氨酸复合剂配方对甘油三酯含量增加较模型组有较明显的减轻，表明高剂量的茶氨酸复合剂配方对脂肪代谢影响较大，说明茶氨酸复合剂可能通过抑制氧化应激和脂质过氧化反应发挥其保护肝脏的作用。

此外，茶氨酸复合剂高、中、低剂量组实验大鼠肝脏形态学改变与模型、对照组相比均有一定的改善，表明茶氨酸复合剂在降低及延缓酒精性肝损伤、防止酒精性肝病病情进一步恶化方面可能具有较好的作用效果；总体来看，高剂量茶氨酸复合剂对酒精引起的肝损伤保护功能显著。其相关的药理和分子机理有待进一步深入研究。

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The Protective Effect of Theanine Complex on the Rat Against Alcoholic Liver Injury

LI Da-wei1,ZHANG Shi-kang1*,WU Hui-ling2,ZHU Yue-jin1,SHI Hai-gen1,SONG Yan-hua2,ZHANG Hai-hua1,
(1.Hang zhou Tea Research Institute,China Coop,Hangzhou 310016,China;2.Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention,Hangzhou 310051,China)

The protective effect of theanine complex on rat liver of alcoholic injury was studied by the AIL rat models.The AIL rat models were established by intragastric administration of 50%ethanol per day for a month.60 rats were randomly separated into 6 groups.The administrative doses of theanine complex were 0.1,0.2 or 0.4 g/(kg·d)corresponding to the low,middle and high dose rats model,respectively.The HWXC purchased from local market was selected as control and the administrative dose was 1.5 g/(kg·d).The blank group was oral administration instead with the same dose of water.The evaluation of pathology and biochemical parameters （ALT、AST、TG）was analyzed.The results showed that the contents of ALT,AST and TG decreased significantly in all the doses groups.Pathology demonstrated that theanine complex can protect rat from fatty liver induced by alcohol.In general,the theanine complex has a protective effect on the rat liver with alcoholic injury.

Theanine complex,Alcoholic liver injury in rats,Protective effect

2012-02-09

浙江省茶产业技术创新联盟项目；茶资源高效利用与跨界产品开发新技术集成研究示范

李大伟（1983-），男，吉林长春人，助理研究员，从事天然产物化学与生物学研究。

*通讯作者：zsk6510@126.com