人参内生真菌群落结构及其与有效成分相关性分析

张亚光，张艳欣，高 崎

（上海上药杏灵科技药业股份有限公司·上海上海·201703）

人参为五加科植物人参 （Panax ginseng C.A.Mey）的干燥根和根茎，是我国传统中药材，《神农本草经》将其列为上品，认为其具有大补元气、安神益智的功效，在现代临床药理研究表明，人参能够在提升免疫力、抗肿瘤、改善心血管等多个方面发挥显著作用[1,2]。因栽培种植方式不同，人参有林下山参和园参之分，价格悬殊，质量也存在差异。目前国内外对人参道地药材的研究主要集中于遗传多样性、药理作用以及生态环境等方面，作为一系列生理生化反应、能量与物质代谢的植物体内环境对药材道地性的形成同样具有重要的作用[3,4]。特别是药材的生长发育过程中，一些次生代谢产物和有效药用成分的累积与内部真菌介导的调节作用密切相关[5]。

田间人工种植条件下收获的人参为园参，生长周期短，5年左右采收。林下山参的种植方式是将参籽广播于山野林间，任其自然生长，一般称生长年限在15年以上的为林下山参。从药用成分含量及内生菌群落结构角度揭示二者之间的差异，对于人参栽培方式的指导、质量的控制以及市场环境的调节有一定的现实意义。人工条件下化肥和农药的施用会对土壤的理化特征造成影响，进而改变了土壤微生物组成[6]。植物在生长过程中，和根际微生物逐步形成共生关系，所以两者内生菌会存在差异。说明人工干预的种植过程会对药材中内生菌为主的内环境也产生影响[7]。

人参道地药材的生长发育过程中，一些次生代谢产物和药用成分的累积与内部微生物介导的调节有直接关系[8]。本实验借助LC/MS技术对两种不同的栽培方式的人参内生真菌与人参主要药用成分对含量相关性分析，为人参中真菌的开发和利用提供研究基础。内生真菌与植物所构成的体内微生态系统的初步研究，以及产生的化学成分的差异和影响，将有助于从内部环境来阐释道地人参药材的形成机制[9]。

1 材料和方法

1.1 实验试剂

植物DNA提取试剂盒、引物合成、Tap Mix酶均由生工生物技术（上海）有限公司提供；甲醇、乙腈为色谱纯购自德国Merck公司；乙醇、马铃薯葡萄糖琼脂、次氯酸钠均为国药有限公司提供；实验用标准品:人参皂苷Rg1 (批号 Z13O8L45576)、Re (批 号B10M8S35243)、Rb1(批 号Z16J9X52719)、Rc(批 号M18J9S53098)、Rd(批 号Z13N8X48155)、Rg2(批 号M17M8S31526)、Rb2(批号P09M8F35575)、Rf(批号P09M8F31017)、Rb3(批号Y05A8Y41182)购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2 实验材料

本研究在辽宁桓仁县人参种植基地 （41。03＇N，125。30＇W）进行，该地属于中国的东北地区。共使用了10份新鲜人参样本，根据种植方式分为两组，5年参龄园参、林下山参各5支。从取样区域中心位置内设5点随机取样[10,11]，每组5支平行样本。摇动根以去除松散粘附的土壤，然后冲洗，直到根须上没有可见的土壤颗粒，冷冻保鲜带回实验室，用于植物内生真菌18S基因分析[12]。我们将本研究中的植物共生微生物研究范围明确为人参芦头下方1～3cm位置的根部去除外表皮后的内部组织中的内生真菌。

1.3 样品的处理及DNA提取

摇动根以去除松散粘附的土壤，超净台内继续用灭菌水清洗干净样品外表面，用无菌刀片将根茎样品切成10×10mm的片段。取人参内部组织片段先在75%乙醇溶液中表面浸泡1 min，转移到5%次氯酸钠溶液中7 min，之后用75%乙醇浸泡1 min[13]。将表面灭菌的样品用无菌水漂洗5次，并用无菌滤纸吸干。取各样品适量，将处理过的样品取内部组织剪碎放置研钵内，液氮研磨后置1.5 mL无菌试管中，而后用试剂盒方法提取基因组DNA。DNA样品用琼脂糖凝胶电泳及紫外蛋白核酸测定仪(Nano Drop one，GENEQUANT，Eppendorf)检测质量与纯度。将核酸浓度用去离子水调配到50 ng/μL，-80℃保存备用。

1.4 PCR扩增和产物纯化

以上述基因提取方法分别得到供试样品DNA，并对植物的内生真菌18S V5-V7区合成扩增引物并分别进行PCR扩增[14;15]，引物序列如下:

817F: （TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA），1196R:（TCTGGACCTGGTGAGTTTCC）；

内生真菌PCR扩增程序如下:

①95℃预变性5min；②95℃变性35s；③55℃退火35s；④72℃延伸50s；⑤步骤2～4循环25次；⑥72℃延伸5min；⑦4℃10min后终止。PCR反应在ABI ProFlex PCR热循环仪中进行。扩增后使用凝胶法纯化回收并检验。

1.5 高通量测序和分析

PCR反应中扩增出各DNA的18S区域，经过1.5%琼脂糖凝胶法纯化回收后，提交上海美吉生物医药有限公司进行测序[16]。全部序列经过滤低重复序列和嵌合体后，进行操作分类单元聚类，OTUs的相似性为97%，利用blastn将OTU序列逐条与Unite数据库进行比对，比对的结果用于物种注释，之后构建目水平的物种分类图[17]。使用R的vegan package进行主成分分析（PCA），以Simpson多样性指数进行样品之间的多样性分析[18]。

1.6 液相和质谱条件

色谱条件:色谱柱Waters CORTECS C18（150 mm×4.6 mm,2.7μm），检测波长203 nm,柱温30。C，进样量5μL，流速1.0 mL/min，A相为0.1%甲酸-水溶液，B相为0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脱程序见表1所示。

表1 梯度洗脱程序表Table 1 Gradient elution schedule

质谱条件:采用电喷雾离子源（ESI）负离子检测模式采集质量范围（Mass range）:50-1200 Da；毛细管电压 （Capillary Voltage）:2.5 kV； 锥孔电压（Sampling Cone Voltage）:30 V；离子源温度（Soure Temperature）:120。C；去溶剂化温度（Desolvation Temperature）:500。C；去溶剂化气体流量 （Desolvation Gas Flow）:800 L/hr；锥孔气体流量(Cone Gas Flow）:50 L/hr；碰撞气:氩气；校正液:0.5 mM甲酸钠、2 ng/mL亮氨酸脑啡肽（Leu-enkephaline，LE），负离子模式下LE[M-H]-精确分子量以m/z 554.2615计；碰撞气体氩气；高碰撞能量通道:10～40 eV能量梯度。

1.7 主要成分含量的测定

1.7.1 样品制备

取林下山参干品，粉碎，过5号筛（80目），精密称定2.00 g，加70%甲醇20.00 mL，超声（200 W,40 KHz）100 min，温度50。C，滤过并弃去初滤液，精密量取续滤液10.00 mL，旋转蒸发至干，残渣加70%甲醇溶解并转移至2 mL容量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.22μm滤膜，即得。

1.7.2 标准曲线绘制

精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rc对照品、人参皂苷Rd对照品、人参皂苷Rb2对照品、人参皂苷Rb3对照品、人参皂苷Rg2对照品各1.00 mg，加入甲醇溶解制成1.0 mg/mL的对照品溶液，再加甲醇逐级稀释进样。以浓度纵坐标，峰面积为横坐标，得到5种人参皂含量测定标准曲线。

表2 主要成分线性方程表.Table 2 Table of main component linear equations

1.8 人参内生真菌菌群结构与人参皂苷含量的相关性分析方法

选取人参次生代谢物数据进行整理，同时对分析所得的内生菌丰度数据进行排序，采用R语言统计软件对内生菌数据以及人参皂苷数据进行统计分析，形成相关性热图并得出相关性系数是否显著(P＜0.05)。主要选择可用于反映3种药典中规定的皂苷检测物（Rg1、Re和Rb1）以及2种高含量的人参皂苷检出物（Rc、Rd）进行进一步分析。可用于反映与人参内生真菌群落中丰度排名前20的物种的相互关系。

2 结果与分析

2.1 样品的预处理结果以及PCR扩增结果

样品所提取的基因调配到同一浓度后采用琼脂糖凝胶法检验，基因完整性良好（如图1）。采用适宜条件进行PCR扩增、检测和分析，以保证后续分析结果的准确性[19;20]。样品内生真菌扩增后可得到适宜浓度产物。

图1 基因组DNA电泳Figure 1 Genomic DNA electrophoresis

2.2 序列统计与多样性分析

对10支人参内生真菌的Miseq测序和聚类分析。测定得到522303条有效序列，按照97%的相似性聚成OTUs，共获得137个OTUs。维恩图代表样品类群整体OTUs数目，两组中分别含103和87个OTUs（图2）。为比较不同产地人参内生真菌群落的多样性，按最小序列数44146抽平 （标准化）[21]。Shannon和Chao指数越大，说明对应样品中的真菌群落多样性越丰富；Simpson指数则相反，指数越大，对应样品中的真菌群落多样性越小。多样性指数从高到低的顺序为L＞R。如表2所示，分析得出园参中内生真菌的多样性较大。

图2 不同栽培方式的人参内生真菌OTU维恩图Figure 2 Venn diagram of OTUs distribution of endophytic bacterial community detected in Ginseng

表3 不同栽培方式人参内生真菌群落的多样性分析Table 3 Diversity analysis of ginseng endophytic fungi community

2.3 人参内生真菌相对丰度分析

门水平分类学分析图(图3)表明样本中，多达70%的reads属于子囊菌门真菌，L组为林下山参，R组为园参，门水平菌群相对丰度在两类样品之间有所不同。同龄林下山参和园参的内生真菌组成存在差异[16,22]。对应的真菌类群涉及到7个门 （子囊菌门Ascomycota、担子菌门Basidiomycota、毛霉菌门Mucoromycota、纤毛亚门Ciliophora及一些相对丰度较小的门类），包括33纲、51目、62科[23]。

图3 两类样品中内生真菌多样性Figure 3 Dominant bacterial genera detected from endophytic bacterial community in Ginseng

2.5 人参内生真菌主成分分析

以两种不同栽培方式人参样品为目标进行PCA分析，通过对不同生境或微生物群落间的物种多样性进行组间比较分析，探索不同分组样本间群落组成的相似性或差异性[24,25]。其中，林下山参位于二、三象限，园参位于一、四象限，分异性较大。通过聚类和PCA分析表明，不同栽培方式的人参内生真菌群落具有差异性。

图4 两类样品中内生真菌结构PCA分析Figure 4 PCA analysis of endophytic fungal structure in two types of samples

2.6 人参化学成分含量测定结果，详见表4。

表4 人参化学成分含量测定结果Table 4 Table of results of determination of chemical composition of ginseng

2.7 主要色谱峰的解析

人参皂苷是由人参皂苷元与糖通过-O-相连构成的糖氧苷类化合物，电喷雾电离(ESI)属于软电离，人参皂苷类成分在负离子模式下的ESI源中通常具有良好的离子化效率，从而得到化合物相应的相对分子质量信息。通过UPLC-MSMS技术，为化合物的结构解析提供丰富的信息。人参皂苷类成分的多级质谱裂解规律表明，在碰撞能的作用下，人参皂苷主要发生糖苷键的断裂，质谱给出失去一个或多个糖的次级苷和苷元的碎片离子，从而帮助我们对人参皂苷进行解析。本研究根据ESI（负离子）检测模式下得到的碎片离子信息，对林下山参指纹图谱所含的人参皂苷进行解析。结果见表5。

表5 林下山参指纹图谱共有峰的鉴定结果Table 5 Results of identification of common peaks of fingerprints of ginseng

2.8 基于人参的化学成分含量的林下山参与园参的鉴别

对林下山参和园参指纹图谱进行对比，共得到33个共有峰。以33个共有峰的峰面积为变量，导入SIMCA-P 14.0软件中，进行主成分分析，得到的结果如图所示。显示林下山参和园参样品分布于坐标轴左右两侧，表明之间存在质量差异。

图5 林下山参与园参的鉴别Figure 5 Differences in participating in garden ginseng under forest

2.9 化学成分和内生真菌的相关性分析

经过化学成分检测，2种栽培方式的人参中Rg1、Rb1、Re含量均高于《中国药典》2020年版中的人参皂苷标准。其中Rc和Rd为检测出的含量比较高的人参皂苷。为了进一步分析与人参皂苷含量有相关性的内生真菌，此处利用Spearman相关性分析建立两种栽培方式人参内生真菌的优势菌属与人参皂苷含量的多元线性回归方程，对数据进行分组并排序后进行统计，得出相关性系数（P＜0.05），最后将内生真菌进行筛选，构建出相关性热图。

通过对人参内生真菌群落中相对丰度前20的组成菌属与人参皂苷有效成分含量的相关性分析表明，部分真菌类群与5种药用活性成分的相关性较大，特别是指标性成分Rg1、Re、Rb1。短梗霉属、毛壳菌属及曲霉菌属球囊霉属等均与药典人参中3种药用成分Rg1、Re、Rb1呈现含量正相关关系；子囊菌属与Rg1、Rb1、Rc和Rd存在一定程度的负相关关系。这些结果表明，人参内生真菌群落组成与人参皂苷活性成分之间存在相关性。

图6 人参中化学成分和内生真菌相关性热图Figure 6 Heat map of chemical composition and endophytic fungi in Ginseng

3 讨论

植物与生长环境中接触到的微生物互利共生，部分形成紧密共生关系。一些定殖的真菌在植物体内发挥着重要的生态功能，对植物内次生代谢物的形成起着重要调控作用，进而改变植物对环境的适应能力[26]。本研究中，园参和林下山参都与不同的内生真菌群落密切相关。种子萌芽生根后先从自身或者当地的土壤环境中，预组装成一定特有的内生菌群，并应用于内部代谢的调节和抵抗外来微生物的入侵[27]。与园参相比，同参龄林下山参内生真菌群含有较丰富的物种与遗传多样性，占主要地位的四门细菌菌群相对丰度在两类样品之间有所不同。园参生产中施用化肥会引入外来微生物，使用农药会对土壤环境中微生物的多样性产生影响。林下山参和园参所使用的种子基源相同，而其中的内生菌多样性存在差异，不同栽培环境中的差异会引起真菌组成差异。

植物内生菌是具有很大挖掘潜力的微生物资源，迄今已有众多研究可以证实其与植物次生代谢产物的含量息息相关，一些研究发现，多粘类芽孢杆菌与人生共培养后可提高稀有皂苷含量，这就为道地药材的深度研究提供了途径[28,29]。本论文旨在开展道地药材与不同品质药材内生真菌差异研究，分析得到其种群多样性和功能差异，可从内生菌着手阐释道地药材形成的相关因素加以研究。同时为通过恢复原有微生物群落解决人参连作障碍提供研究资料。林下山参和园参不同的生长环境，影响着次生代谢物的积累过程，通过对五种主要人参皂苷的含量的准确定量以及其他化合物质成分含量的比较，从化学物质含量差异揭示二者的差异。利用LC/MS技术，对化学物质成分进行进一步解析，从而明确植物内生菌与道地药材的影响和关联，为中药材道地性的研究探索一条有效途径。内生真菌种类繁多，人参化学物质成分复杂多样，本文仅从人参皂苷与内生菌的关联来阐释不同栽培方式人参的差异，后续研究可以对人参挥发油、多糖、有机酸等更全面的物质基础进行深入研究，以期更加全面解读人参内生菌群落与栽培方式的关联性。