一种染病太子参微生物群落及致病菌的分析

赵 立，魏 丹，贺潇宇，蒋静怡，庞文生，胡 娟,2*

(1.福建中医药大学，福州350122；2.福建中医药大学附属第二人民医院，福州350122)

太子参为石竹科植物孩儿参 （Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax ex Pax et Hoffm.）的块根，富含多糖、氨基酸、环肽、脂肪酸等营养成分，具有益气健脾生津润肺的功效[1]。 福建省宁德市柘荣县为太子参主产区，是太子参单品种区划的“最佳生产适宜区” 和全国太子参主要集散地之一[2]。 太子参年种植面积3 万多亩，约占当地农业收入的60%～70%，占有极其重要的地位[3]。

然而，随着土地太子参种植年份的增长，致病菌增多，连作障碍问题加重。目前已报道的太子参病害包括叶斑病、立枯病、根腐病、紫纹羽病和白绢病等，随着分子生物学技术的发展， 为太子参不同的病原菌的发现提供了技术手段， 目前主要鉴定出的太子参病原菌有尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、 齐整小核菌Sclerotium rolfsii 等[4,5]。 本课题组发现，一些地块儿出现红色的太子参，其原因不明。本研究对这种外观呈红色的染病太子参采样， 并对其微生物结构及病原菌进行分析检测，探究发病机制，为其科学防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Techne PCR 仪（Gene E）；Starter 3C pH 计（奥豪斯仪器（上海）有限公司）；MK2000-1 恒温金属浴（杭州奥胜仪器有限公司）；5430 离心机 （德国Eppendorf公司）；SW-CJ-1FD 超净工作台（苏净安泰）；Mini-4 超纯水仪（英国Kertone 公司）；DW-25L262 医用低温保存箱（青岛海尔特种电器有限公司）；BioRadModel 200/2.0 电泳仪 （美国伯乐公司）；Nanodrop2000 紫外分光光度计（美国Thermo 公司）；JS-680D 凝胶成像仪（上海培清科技有限公司）；LMQ.C 高压灭菌锅（上海博讯实业有限公司）；Qubit 荧光光度计 （美国Thermo 公司）；SequelII 测序仪（美国Thermo 公司）。

1.2 病害调查与样本的采集

2019 年期间，于福建省柘荣县（119°51′6″ E，27°12′38″N）调查了当地主栽品种太子参红根的田间发生情况，记录病害典型症状，并采集代表性样品用于微生物多样性分析。

1.3 基因组DNA 的提取和PCR 扩增

采用基因组提取试剂盒对病害和正常太子参的基因组DNA 进行提取， 之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的纯度和浓度，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1ng/μL。 以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带Barcode 的特异引物，Toyobo 公司的KOD 酶，进行PCR，确保扩增效率和准确性。

1.4 PCR 产物的混样和纯化

PCR 产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，根据PCR 产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物， 对目的条带使用Thermo 公司提供的胶回收试剂盒回收产物。

1.5 文库构建和上机测序

使用DNA 黏合酶将测序接头连接在扩增好的DNA 片段两端，使用AMpure PB 磁珠对DNA 片段进行纯化选择， 构建SMRT Bell 文库。 纯化后的片段经buffer 回溶后，使用BluePipin 片段筛选特定大小的片段，并AMpure PB 磁珠对DNA 片段进行纯化。 构建好的文库经Qubit 浓度定量， 并利用Agilent 2100 检测插入片段大小，随后用PacBio 平台进行测序。

1.6 测序数据处理

将PacBio 下机数据导出bam 格式文件。使用lima软件根据barcode 序列区分各样本的数据， 所有样本的序列以bam 格式保存。 然后使用CCS (SMRT Link v7.0)对序列进行校正，矫正参数为：CCS=3，最小准确率为0.99，并去除长度小于1340、最长序列长度大于1640 的序列，以fastq 和fasta 保存；随后进行SSR 过滤并使用cutadapt 去除掉引物， 将含有连续相同碱基数＞8 的序列过滤掉。 经过以上处理后得到的Reads 即最终的有效数据（Clean Reads）。

利用Uparse 软件 （Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/） 对所有样品的全部Clean Reads 进行聚类，默认以97%的一致性（Identity）将序列聚类成为OTUs（Operational Taxonomic Units），同时会选取OTUs的代表性序列，依据其算法原则，筛选的是OTUs 中出现频数最高的序列作为OTUs 的代表序列。 对OTUs代表序列进行物种注释， 用Mothur 方法与SILVA（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA 数据库进行物种注释分析（设定阈值为0.8～1），获得分类学信息并分别在各个分类水平：kingdom （界），phylum （门），class（纲），order（目），family（科），genus（属），species（种）统计各样本的群落组成。

2 结果与分析

2.1 病害采样与症状观察

采集得到的患有红根和正常太子参样品见图1，由图1 可见正常的太子参呈淡黄色且表明质地光华，而患有红根的太子参呈红棕色，表面粗糙，其形态明显呈发育不良状态。

图1 红根太子参发病症状观察

2.2 不同太子参微生物群落分析

根据物种注释结果， 在各分类水平上统计各样本的群落组成，生成物种相对丰度柱状累积图，以便形象直观地比较各样本在不同分类水平上相对丰度较高的物种及比例。以门水平物种相对丰度柱形图为例，分析红根和正常太子参微生物群落差异，详见图2。

图2 门分类水平红根、正常太子参细菌群落组成

由图2 可知，在细菌水平上，红根、正常太子参细菌群落结构存在较大差异， 其中丰度较高的门类有变形菌门（Proteobacteria）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）。 各细菌相对含量分析显示，红根太子参优势类群为变形菌门、放线菌门和后壁菌门；而正常太子参优势类群为变形菌门、 蓝细菌门和放线菌门。 相对正常参，红根太子参主要增加了变形菌门、后壁菌门的相对丰度， 分别提高了46.75%和7.91%；降低蓝细菌门、 放线菌门的相对丰度， 分别降低了40.05%和13.23%。

2.3 不同太子参微生物种群分析

对红根和正常的细菌群落进行进一步富集， 之后进行高通量测序建库， 使用长读长Pacbio 测序技术，对其所含的细菌进行长读长测序，并通过数据分析，得知细菌群落中含有哪些细菌，及丰度含量。由于使用了长读长测序技术，细菌可以鉴定到“种”（species）级别。通过太子参根部微生物测序后的物种分析， 主要鉴定得到的细菌微生物种类有90 余种，几种代表性菌株鉴定检测结果见图3。 其中，在发病太子参中所检测得到的Paraburkholderia_phenazinium 菌含量极高，达到了10.71%； 而正常太子参中该菌种含量极低， 仅占0.38%，发病太子参该菌含量是正常参的28.18 倍。 因此，初步推断该菌与太子参发育不良存在相关性。

图3 种分类水平红根、正常太子参细菌群落组成

3 结论与讨论

根部发红是太子参连作过程中主要的发病症状之一， 而微生物群落的改变及致病菌的滋生是植物发病的重要因素。因此，对于该发病植物的微生物物种及病菌分析十分重要。

本实验进一步采用16S RNA 技术对太子参发病根部的微生物群落进行分析，从门类分析上看，太子参感染红根后根部变形菌、厚壁菌相对丰度增加，而蓝细菌、放线菌相对丰度降低。 蓝细菌可以为植物提供十分重要的有机碳源，是植物生长过程中极为重要的初级生产力[6]；放线菌门中包含许多可产抗生素、酶和有机酸等有益于植物生长的细菌[7]；变形菌门在所有细菌菌门中最为普遍，同时也包含大量动植物病原菌，其相对含量增加可能引起植物抵抗力降低，植株发病率增加[8]。 因此，这些菌群分布的失衡， 是造成太子参植物发病的重要因素。

为了进一步分析太子参根部的致病性菌株， 本实验对于根部中所含的菌种进行了鉴定。 研究结果发现病变后的太子参含有大量的Paraburkholderia_phenazinium 菌， 而正常的太子参该菌的含量极少，发病太子参该菌含量是正常参的28.18 倍。

Paraburkholderia_phenazinium 为变形菌门，β-变形菌纲，伯克氏菌目，伯克氏菌科，伯克霍尔德菌属下的菌株[9]。 伯克霍尔德菌在植物及土壤中分布广泛，目前该菌属共有122 个种[10]。 目前大多数对于该菌的报道属于对植物有益的微生物，如可以通过固氮、溶磷和分泌植物激素等作用促进植物生长， 还可产生硝吡咯菌素、 吩嗪、cepaciamide A、 cepabactin、cepacidine A等多种抑菌产物[11,12]。

由于大部分伯克霍尔德菌表现出对植物有益的特性，因此20 世纪90 年代，美国环境保护署对含有伯克霍尔德氏菌菌株的几种生防剂进行了注册。 在过去的几年里，伯克霍尔德氏菌的新物种的数量大幅增加。但经过风险评估后，这些产品从市场上撤出，并暂停了含有伯克霍尔德氏菌的产品的注册。

随着其新物种的数量不断增加， 一些伯克霍尔德氏菌具有有害的属性。例如，在水稻中发现的伯克霍尔德菌Burkholderia plantarii、 Burkholderia gladioli 等是引起水稻秧苗细菌性立枯病的重要病原菌之一， 其侵染性、繁殖力及适应性均很强，严重威胁水稻生产[13]。因此， 目前区分伯克霍尔德菌属下各菌株的有益及有害属性仍是急需解决的科学问题。

从发病太子参中检测出含有大量的Paraburkholderia_phenazinium 菌。 Paraburkholderia_phenazinium菌是一种能够产酚秦碘色素的菌株，在酸性pH 值下，吩嗪色素可以被还原成红色， 可能是太子参发病根部颜色改变的原因[14]。 吩嗪色素虽然也具有抑菌的活性，但同时具有细胞毒性，会影响根部的正常生理，导致植株发育不良， 这可能是引发太子参根部发育不良的重要因素[15]。 此外，该菌株在酸性土壤中具有竞争性优势， 这也与课题组前期所测得太子参土壤呈弱酸性的结果较为一致[16]。 基于以上几点分析，推断Paraburkholderia_phenazinium 菌与太子参发病存在相关性。

本研究首次对一种染病呈红色的太子参微生物群落进行了分析， 并对其发病原因进行了探讨， 通过分析，初步确定了Paraburkholderia_phenazinium 菌可能是造成太子参发育不良的原因， 但目前关于伯克霍尔德菌的好处及危害仍处于争论之中， 且对于该病害的田间传播规律及发病机制尚没有报道。因此，仍需要加强田间病害监测，了解其发病规律，此外，对于该植物的发病机制还有待于进一步研究， 从而制定对应的防控策略。