HPLC-FLD 法测定北细辛药材中甲基丁香酚的含量

刘芳馨，黄 鑫，张 涛，王恩鹏，鲍慧玮，周 嵘，陈长宝

（长春中医药大学药学院·吉林长春·130117）

北细辛为马兜铃科植物北细辛Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum （Maxim.）Kitag.的干燥根及根茎，主产于辽宁的抚顺、丹东、吉林长白山以及黑龙江等地。北细辛具有解表散寒、祛风止痛、通窍、温肺化饮等功效[1]。 北细辛中化学成分较复杂，包括挥发性的甲基丁香酚、细辛脂素、黄樟醚、榄香素等以及木脂素类的细辛脂素和痕量的马兜铃酸[2]。其中甲基丁香酚因其具有降血压、镇咳、祛痰、镇静、镇痛等作用[3-5]，但甲基丁香酚的代谢产物具有化学反应活性，其对机体有致癌和对机体呼吸中枢有抑制作用，有较强的毒副作用[6-8]。因此，检测北细辛药材中甲基丁香酚的含量为以后更加安全有效地使用中药北细辛提供一定的科学理论基础。

根据文献报道， 对北细辛药材中甲基丁香酚含量的测定方法主要包括色谱法、高效毛细管电泳法[9]和紫外吸收光谱法[10]，其中色谱法主要采用紫外检测器[11-12]，尚没有报道应用荧光检测器分析北细辛药材中甲基丁香酚含量。 而甲基丁香酚具有的荧光吸收较强的苯环结构，故本文建立一种HPLC-FLD 法测定中药材北细辛中甲基丁香酚的含量，专属性强，灵敏度高[13-14]，可快速、准确的评价北细辛的质量。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent 1100 型高效液相色谱仪；KQ-250 型双频数控超声波清洗器 （购自昆山市超声仪器有限公司）；FA1004B 型万分之一分析天平（购自上海佑科仪器仪表有限公司）；DFY-500 摇摆式多功能高速中药粉碎机（购自温州顶历医疗器械有限公司）；SHB-Ⅲ循环水式真空泵（购自上海科升仪器有限公司）。

1.2 试剂与试药

北细辛为马兜铃科植物北细辛Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum （Maxim.）Kitag.的根及根茎，经长春中医药大学蔡广知副教授鉴定符合《中国药典》2020 年版一部项下规定；甲基丁香酚（批号：111642-200301），购自中国食品药品检定研究院；HPLC 分析中的甲醇 （批号：20200506） 和乙腈（批号：20200501）均为色谱级，购自美国Fisher 公司；超纯水购自杭州娃哈哈有限公司。

2 方法

2.1 色谱条件

采用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～15min，35%A；15～35min，35%→50%A）； 激发波长为270 nm；发射波长为312nm；流速为1.0 mL/min；柱温为30℃；进样量为20μL。

图1 北细辛药材HPLC-FLD 色谱图（A.对照品溶液；B.供试品溶液；1.甲基丁香酚）Figure 1 HPLC-FLD chromatograms of North Asarum (A.reference solution; B. sample solution;1. methyleugenol)

2.2 对照品溶液的制备

取甲基丁香酚对照品适量，精密称定，用甲醇溶解定容至10mL，作为甲基丁香酚对照品母液；再精密移取1mL，用甲醇稀释定容至10mL，制成1mL 含10.1μg甲基丁香酚的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取北细辛药材粉末（过六号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理（功率500W，频率40kHz）40 分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察

移取“2.2” 项下甲基丁香酚对照品母液，分别用甲醇稀释0、2、4、10、20、100 倍，作为系列对照品溶液，按“2.1” 项下色谱条件进行进样分析。 以峰面积为纵坐标（Y），甲基丁香酚浓度为横坐标（X），绘制标准曲线。 得到回归方程为Y=4500X-1010.1（r=0.9997），表明甲基丁香酚在1.01～101μg/mL 浓度范围内与峰面积的线性关系良好。

2.5 精密度试验

取“2.3” 项下北细辛供试品溶液，按照“2.1” 项下色谱条件，连续进样6 次，计算得到甲基丁香酚色谱峰面积的RSD 值为0.55%，说明该仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取批号为20200901 的北细辛药材，粉碎，过六号筛，精密称取0.5g 粉末，按“2.3” 项下方法操作，平行制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项下色谱条件进样分析。计算得到北细辛供试品中甲基丁香酚的平均含量为0.085%，RSD 值为1.25%， 说明该制备方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取“2.3” 项下北细辛供试品溶液，置于室温，分别于0、2、4、6、8、12、24h，注入高效液相色谱仪中进行分析， 计算得到甲基丁香酚色谱峰面积的RSD 值为0.93%，说明制备的北细辛供试品溶液在24h 内稳定性较好。

2.8 加样回收试验

取甲基丁香酚对照品约4mg，精密称定，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，作为加样回收试验的对照品溶液。 取已知含量的批号为20200901 的北细辛药材，粉碎，过六号筛，称取粉末6 份，每份约0.25g，分别置25mL 具塞锥形瓶中，再精密移取上述对照品溶液0.4mL，按“2.3” 项下方法制备供试品溶液。在“2.1” 项下色谱条件进样分析，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果Table 1 Experimental results of sample recovery

2.9 含量测定

分别取9 批北细辛药材，按照“2.3” 项下处理样品，制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进行分析，记录甲基丁香酚色谱峰面积。 采用外标法计算北细辛药材中甲基丁香酚含量。 结果见表2。

表2 北细辛药材中甲基丁香酚含量（%）Table 2 Content of methyleugenol in North Asarum(%)

3 结论与讨论

通过上述实验研究表明，采用荧光检测器测定时，本身具有较好的灵敏度及准确度， 且甲基丁香酚具有荧光吸收特性，又具备良好的专属性，能满足北细辛药材中甲基丁香酚含量的测定， 可作为北细辛药材质量控制的参考方法。

本文对色谱分析条件进行了考察。首先，与紫外检测器进行比较。 采用紫外检测器测定时[15-16]，北细辛供试品的杂质峰较多，专属性不强，灵敏度低，考虑到甲基丁香酚特有的苯环结构， 故采用荧光检测器进行分析；其次，进行了流动相的筛选。 当采用甲醇-水和乙腈-水进行洗脱时[17-18]，甲基丁香酚色谱峰的峰形不对称，拖尾较严重，当流动相体系更换成乙腈-0.1%磷酸溶液时，拖尾现象得到改善，故选用乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相；最后，对洗脱条件进行考察。采用乙腈-0.1%磷酸溶液等度洗脱时，待测色谱峰与相邻色谱峰不能完成分离，更换梯度洗脱程序后，分离完全，可更准确的分析甲基丁香酚含量。