黑三七中总皂苷的含量测定

徐芳菲，冯惠柳，李 蕾，初赛君，于 晶，娄子恒，曹志强

（吉林人参研究院·吉林通化·134001）

三七为五加科(Araliaceae) 植物三七Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen 的干燥根和根茎[1]，是我国传统名贵中药材。 三七作为药用的历史悠久，在《本草纲目》以前的《医门秘旨》、《跌损妙方》中就已有记载，在我国已有400 多年的栽培历史，出产于云南、广西等地[2]。 皂苷是中药三七的主要化学成分， 也是大众公认的三七主要活性成分之一。其主要药理作用为对血液系统、免疫调节系统、心脑血管系统、神经系统等的影响[2～5]。

黑三七是三七新的加工品，以三七为原料，经过蒸制、干燥加工的黑色或深棕色的产品。 通过加工炮制，三七中皂苷类成分的结构发生显著变化，主要包括C-20、C-6 和C-3 糖基的水解和糖基水解后C-20 位的脱水反应。 使高极性皂苷类成分经蒸制后急剧下降，转化为生三七中不存在的低极性皂苷类成分[6]。 研究发现，黑三七中含有人参皂苷Rg3、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rg5、人参皂苷Rk3、人参皂苷Rk1 等稀有皂苷[7-8]。研究发现，稀有人参皂苷具有较好抗肿瘤[9-12]、保护心血管[13-16]、增强免疫力等药理作用[17-19]。化学成分是药效的重要物质基础，本文对黑三七中总皂苷的测定方法进行系统研究，并进行多批次样品的含量测定， 为黑三七的基础成分研究提供了参考依据， 也为黑三七的质量控制奠定了基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

紫外可见分光光度计（上海光谱，型号SP-1920）；电热恒温水浴锅 （金坛市白塔金昌实验仪器厂，HH-6）；电子天平（赛多利斯，型号SQP）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，KQ500-DE ）； 智能高速冷冻离心机（湖南赫西，3H16RI）。

1.2 材料

黑三七（吉林人参研究院自制）；人参皂苷Re 标准品( 中国食品药品检定研究院， 批号110754-201827)；无水乙醇、甲醇、浓硫酸、苯酚( 北京化工厂，分析纯) ；香草醛( 天津市光复科技发展有限公司，分析纯) 。

2 方法

2.1 对照品溶液的制备

称取人参皂苷Re 对照品约10mg，精密称定，加甲醇一定量溶解后定容至10mL 量瓶中，摇匀，即得（浓度为1.05mg/mL）。

2.2 供试品溶液的制备

样品65℃烘干后，粉碎，过80 目筛，得样品粉末。取样品粉末0.5g，精密称定，加75%乙醇加热回流提取3 次，每次10mL，提取时间2h，合并滤液，蒸干。残渣加甲醇定容到10mL 量瓶中，0.3 加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤（0.45μm），取续滤液，即为供试品溶液。

2.3 溶液的配制

2.3.1 72%硫酸溶液

取硫酸72mL，缓缓注入适量水中，冷却至室温，加水稀释至100mL，摇匀，即得。

2.3.2 8%香草醛乙醇试液

取香草醛0.8g，加无水乙醇使溶解成10mL，即得。

2.3.3 5%苯酚溶液

取苯酚1g，加入蒸馏水20mL，摇匀，即得。

2.4 标准曲线的绘制

精密吸取人参皂苷Re 对照品溶液10、20、30、40、60、80、100μL，分别放入带塞磨口试管中，水浴挥干甲醇，加（2.3.1）5mL，（2.3.2）0.5mL，充分振摇后，置恒温水浴上60℃加热10min， 立即使用冰水浴冷却10～12min，摇匀。采用试剂做空白，按照紫外—可见分光光度法在544nm 波长处分别测定其吸光度。 纵坐标为吸光度，横坐标为质量（μg），绘制标准曲线，计算回归方程。

2.5 总皂苷含量测定

精密吸取制备的供试品溶液（2.2）10～20μL，放入具塞的刻度试管中， 水浴挥干甲醇后， 加入（2.3.1）5mL，（2.3.2）0.5mL，充分后振摇，置恒温水浴上60℃加热10min，立即用冰水浴冷却10～12min，摇匀。 以试剂做空白，采取紫外-分光光度法于544nm 波长处，测定吸光度， 通过标准曲线来计算待测样品中总皂苷的质量m。

2.6 总皂苷含量计算方法

( m 为测得总皂苷的质量，V1为供试品溶液取样体积，V2为供试品溶液定容体积，M 为样品质量)。

2.7 精密度试验

精密吸取人参皂苷Re 对照品溶液30μL，置磨口带塞试管中，水浴挥干甲醇后，按照（2.5）方法处理后，连续测定6 次，记录吸光度值。

2.8 重复性试验

取同一样品分别称取粉末0.5g （精密称定）6 份，按照（2.2）方法制备成6 份供试品溶液，按照（2.5）方法进行测定，分别记录待测样吸光度值。

2.9 加样回收率试验

称取样品（已知含量）6 份，每份0.25g，分别加入人参皂苷Re 对照品溶液5.02（mg/mL）1mL，按照（2.2）方法处理，（2.5）方法进行测定，分别记录待测样吸光度值。

3 结果

3.1 标准曲线的绘制

按照“2.4” 项下的方法分析，绘制标准曲线，得出回归方程。 人参皂苷Re 的回归方程为y = 0.0046x+0.0076，R= 0.9991。 结果表明， 总皂苷质量在10.62～106.20μg 范围内，线性关系良好，详见图1。

图1 标准曲线

3.2 精密度试验

连续6 次测得的实验结果，详见表1。 结果表明：精密度试验RSD（n=6）为1.85%，本方法精密度良好。

表1 精密度试验结果

3.3 重复性试验

依据重复性试验的检测结果，计算RSD（n=6）为3.79%，试验数据见表2。 结果表明：本方法重复性良好。

表2 重复性试验结果

3.4 加样回收率试验

依据测得的检测结果， 计算回收率为79.10～98.01%、平均回收率为88.74%，试验数据见表3。 结果表明：本方法准确度良好。

表3 回收率试验结果

3.5 含量测定

10 批黑三七中总皂苷含量测定结果为5.10%～6.41%，结果见表4。

表4 10 批黑三七中总皂苷含量测定结果

4 讨论

本文采用紫外分光光度法测定黑三七中总皂苷的含量，该方法易操作、重复性高。 黑三七是三七新的加工品，皂苷是三七的主要活性成分，三七在炮制黑三七的过程中皂苷成分会发生水解反应，转化成次及皂苷。从结构上来看，主要特征是母核基本保持不变，发生的反应有脱糖或形成羟基， 脱水生成双键以及C-17 侧链的变化等。 此外，本文还对10 批黑三七进行总皂苷的含量测定，其总皂苷含量均大于5%，结果表明该加工工艺方法较为稳定、可操作性强。本方法的建立可以更好的控制黑三七的产品质量， 也为进一步规范黑三七加工规程提供了有利的评价依据。

本次研究是对黑三七中总皂苷测定的初步探索，未对多年生和多区域平行样本加工的黑三七进行测定，而不同地域、不同环境生长、不同年生的三七在质量、品质等方面均有一定的差异，加工黑三七的质量也具有一定的差异性，下一步将持续对其进行深入研究，并继续探索其中皂苷类成分的组成以及水解反应机理。 以进一步完善和丰富黑三七中有效成分的基础研究工作，为黑三七的药理研究、质量评价和质量控制提供参考依据。