黄连解毒汤中盐酸小檗碱、黄芩苷、黄柏碱、栀子苷的含量测定

李军鸽，王永春，孟珈同，邱智东，唐秋竹

（长春中医药大学·吉林长春·130117）

黄连解毒汤最早记载于东晋葛洪撰写的《肘后备急方》，后由唐代王焘在《外台秘要》第一卷崔氏方一十五首中命名为黄连解毒汤[1-4]，原文“黄连三两，黄芩，黄柏各二两，栀子十四杖擘，以水六升，煮取二升”，黄连解毒汤为清热解毒的经典名方，其主要功效为清热解毒。 主治三焦实热火毒证[5]。 现代研究表明其具有抗炎、保护心血管、保护胃肠粘膜、调血脂、降血糖等作用[6-10]，因其功效广泛，疗效显著，临床一直在沿用。 黄连解毒汤为四味药组成的复方，其化学成分相对简单，主要为生物碱和黄酮类成分， 本研究通过测定黄连解毒汤中盐酸小檗碱、黄芩苷、黄柏碱、栀子苷这些主要化学成分含量，以期为经典名方-黄连解毒汤开发及质量控制研究提供参考。

1 材料与仪器

1.1 药材饮片

黄连饮片 （吉林省北药药材加工有限公司批号：20210511）；黄芩饮片（吉林省北药药材加工有限公司批号：20201005）；黄柏饮片（吉林省北药药材加工有限公司批号：20200712）；栀子饮片（吉林省北药药材加工有限公司批号：20201115）； 以上药材饮片经长春中医药大学翁丽丽教授鉴定及检验均合格。

1.2 仪器与试药

高效液相色谱仪（岛津LC2030）；真空冷冻干燥机（Epsilon 2-4 LSCplus）； 超声波清洗机 （昆山KQ-250B）；万分之一电子天平（梅特勒XS105DU）；盐酸小檗碱对照品 （中国食品药品检定研究院，111638-201907）； 黄柏碱对照品 （中国食品药品检定研究院，111895-201805）；黄芩苷对照品（中国食品药品检定研究院，110715-201318）；栀子苷对照品（中国食品药品检定研究院，110749-201919）；甲醇、乙腈（Fisher，色谱纯）；水为超纯水；其它试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 黄连解毒汤样品制备

《外台秘要》记载“黄连三两，黄芩，黄柏各二两，栀子十四杖擘，以水六升，煮取二升，分二服”。 唐“一两”折合现代13.8g，唐“一升” 折合现代200mL[11-12]，故折算后取黄连41.4g、黄芩27.6g、黄柏27.6g、栀子15g、加水1200mL，用武火保持沸腾，后文火煎煮，煎煮40 分钟，用双层200 目纱布趁热过滤，得药液400mL，冷冻干燥72h，得冻干粉，平行制备4 份，备用。

2.2 含量测定[13-20]

2.2.1 对照品溶液制备

分别取盐酸小檗碱、黄柏碱、黄芩苷、栀子苷对照品， 精密称定， 加甲醇分别制成每1mL 含90μg、100μg、60μg、30μg 的对照品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液制备

2.2.2.1 盐酸小檗碱含量测定

精密称定冻干粉样品0.5g， 精密加甲醇-盐酸（100∶1）的混合液50mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，精密吸取续滤液1mL，置10mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，备用。

2.2.2.2 黄芩苷含量测定

精密称定冻干粉样品0.5g， 精密加70%乙醇100mL，密塞，称定重量，加热回流3 小时，放冷，70%乙醇补足减失重量，摇匀，过滤，精密吸取续滤液1mL，置5mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，备用。

2.2.2.3 黄柏碱、栀子苷含量测定

精密称定冻干粉样品0.5g， 精密加甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30 分钟，放冷，甲醇补足减失重量，摇匀，备用。

2.2.3 色谱条件

2.2.3.1 小檗碱含量测定

Apollo C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）,流动相为乙腈-0.05mol/L 磷酸二氢钾 （以磷酸调pH 为4.0）（25∶75），检测波长354nm，柱温35℃，各对照品进样量5μL，供试品10μL。

2.2.3.2 黄芩苷含量测定

Apollo C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）,流动相为甲醇-0.2%磷酸水（47∶53），检测波长280nm，柱温35℃，对照品和供试品进样量10μL。

2.2.3.3 黄柏碱含量测定

Apollo C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）,流动相为乙腈-0.1%磷酸水（13∶87），检测波长284nm，柱温35℃，对照品和供试品进样量10μL。

2.2.3.4 栀子苷含量测定

Techmate C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）,流动相为乙腈-水（13∶87），检测波长238nm，柱温35℃，对照品进样量5μL，供试品10μL。

3 结果

3.1 专属性

分别吸取供试品溶液和对照品溶液，分别按2.2.3色谱条件进行测定，记录色谱图，详见图1-4，对照品色谱图与供试品色谱图相同保留时间处都有相应色谱峰，分离度符合要求，阴性样品溶液无干扰，说明各方法专属性好。

图1 黄连解毒汤中盐酸小檗碱含量测定色谱图

图2 黄连解毒汤中黄芩苷含量测定色谱图

图3 黄连解毒汤中黄柏碱含量测定色谱图

图4 黄连解毒汤中栀子苷含量测定色谱图

3.2 线性

取盐酸小檗碱对照品溶液（0.3718 mg/mL）分别加甲 醇 稀 释 成0.0186、0.0372、0.0744、0.0930、0.1115、0.1859mg/mL 浓度的对照品溶液， 取黄芩苷对照品溶液（0.1854 mg/mL）分别加甲醇稀释成0.0154、0.0309、0.0618、0.0927、0.1236mg/mL 浓度对照品溶液，取黄柏碱对照品溶液 （0.1912 mg/mL） 分别加甲醇稀释成0.0239、0.0478、0.0717、0.0956、0.1434mg/mL 浓度的对照品溶液，取栀子苷对照品溶液（0.2262mg/mL）分别加甲醇稀释成0.0188、0.0377、0.0753、0.1131、0.1506mg/mL 浓度的对照品溶液，各精密吸取不同浓度盐酸小檗碱和栀子苷对照品溶液5μL， 黄芩苷和黄柏碱10μL，测定峰面积，以进样量（μg）为横坐标（X），峰面积值为纵坐标（Y），进行线性关系考察，结果见表1，可知各化学成分在相应范围内呈良好的线性关系。

表1 线性考察结果

3.3 精密度

取黄连解毒汤冻干粉样品按2.2.2 方法分别制备供试品溶液， 按2.2.3 色谱条件各连续进样测定6 次，每次进样5 μL，记录色谱峰面积值，盐酸小檗碱RSD为0.48 %、黄芩苷RSD 为0.55 %、黄柏碱RSD 为0.66%、栀子苷RSD 为0.83 %，结果表明仪器精密度良好。

3.4 重复性

取黄连解毒汤冻干粉样品6 份，按2.2.2 方法分别制备供试品溶液， 按2.2.3 色谱条件分别测定峰面积，计算含量。 结果盐酸小檗碱含量53.47 mg/g，RSD 为1.97 %；黄芩苷含量89.30 mg/g，RSD 为1.76 %；黄柏碱含量3.54 mg/g，RSD 为2.01 %； 栀子苷含量21.88 mg/g，RSD 为1.38 %。 表明该方法重现性良好。

3.5 稳定性

取黄连解毒汤冻干粉样品， 精密称定0.5g，按2.2.2 方法分别制备供试品溶液， 按2.2.3 色谱条件分别测定峰面积，进样量为5μL，分别于0、2、4、8、12、24 h 进行测定，纪录峰面积，结果显示盐酸小檗碱、黄芩苷、 黄柏碱、 栀子苷峰面积的RSD 分别为1.88 %、1.96%、1.93%、1.74%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

3.6 加样回收率

取已知盐酸小檗碱含量的黄连解毒汤冻干粉6份，每份0.25g，精密称定，各精密加入50ml 盐酸小檗碱标准品（浓度为0.2690mg/mL），按照2.2.2.1 盐酸小檗碱含量测定方法制备供试品溶液，依法测定，回收率平均值为100.37%，RSD 为2.43 %，结果表明该方法准确度良好，结果见表2。

表2 盐酸小檗碱加样回收率结果

取已知黄芩苷含量的黄连解毒汤冻干粉6 份，每份0.25g，精密称定，各精密加入100ml 黄芩苷标准品溶液（浓度为0.2224mg/mL），按照2.2.2.2 黄芩苷含量测定方法制备供试品溶液，依法测定，回收率平均值为99.06%，RSD 为1.41%， 结果表明该方法准确度良好，结果见表3。

表3 黄芩苷加样回收率结果

取已知黄柏碱含量的黄连解毒汤冻干粉6 份，每份0.25g，精密称定，各精密加入25ml 黄柏碱标准品溶液（浓度为0.0424mg/mL），按照2.2.2.3 黄柏碱含量测定方法制备供试品溶液， 依法测定， 回收率平均值为99.94%，RSD 为1.86%， 结果表明该方法准确度良好，结果见表4。

表4 黄柏碱加样回收率结果

取已知栀子苷含量的黄连解毒汤冻干粉6 份，每份0.25g， 精密称定， 各精密加入25ml 栀子苷标准品（浓度为0.2225mg/mL）， 按照2.2.2.3 栀子苷含量测定方法制备供试品溶液， 依法测定， 回收率平均值为99.40%，RSD 为2.28 %，结果表明该方法准确度良好，结果见表5。

表5 栀子苷加样回收率结果

3.7 含量测定

取黄连解毒汤冻干粉三批样品，分别按2.2.2 各方法制备供试品溶液， 按2.2.3 色谱条件分别测定峰面积，计算盐酸小檗碱、黄芩苷黄柏碱、栀子苷含量，结果见表6。

表6 黄连解毒汤三批样品各成分含量测定结果

4 讨论

4.1 测定指标的选择

黄连解毒汤由黄连、 黄芩、 黄柏和栀子四味药组成，主要化学成分有为物碱、黄酮类、环烯醚萜苷类等，这些成分相互作用，共同发挥药效[21]，其中黄连还含有表小檗碱、黄连碱、巴马汀等生物碱[22]，前期通过实验研究，表小檗碱、黄连碱、巴马汀含量较低，可能会导致测定结果误差较大，故没有将表小檗碱、黄连碱、巴马汀作为指标成分。黄柏除了含有黄柏碱外，还含有盐酸小檗碱， 故本研究黄连解毒汤中盐酸小檗碱来源于黄连和黄柏， 黄芩苷和栀子苷是黄芩和栀子发挥药效的主要成分，其含量测定方法比较成熟，对照品易得，再参考2020 版《中国药典》一部各药材项下的含量测定成分，故确定选择盐酸小檗碱、黄芩苷、黄柏碱、栀子苷为黄连解毒汤主要成分。

4.2 样品的提取

黄芩苷含量测定比较了超声和回流提取方法，结果回流提取方法测得的含量高于超声提取方法， 故黄芩苷含量测定选择回流提取， 其他成分含量测定超声提取与回流提取相差不多，故盐酸小檗碱、黄柏碱、栀子苷为超声提取；另外通过单因素考察，以各含量为指标，对提取时间和提取溶剂量进行考察，最终确定盐酸小檗碱超声提取30 分钟，提取溶剂量为50mL，黄芩苷回流3 小时，提取溶剂量为100mL，黄柏碱和栀子苷超声提取30 分钟，提取溶剂量为25mL。

4.3 色谱条件的选择

参考《中国药典》2020 版和相关文献[13-16]中各成分含量测定流动相组成，并对其比例进行考察筛选，结果发现以上各成分保留时间适中，峰型较好，与其他杂峰分离度大于1.5。 因此， 盐酸小檗碱以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾（25∶75）为流动相，黄芩苷以甲醇-0.2%磷酸水（47∶53）为流动相，黄柏碱以乙腈-0.1%磷酸水（13∶87）为流动相，栀子苷以乙腈-水（13∶87）为流动相，同时分别对25、30、35℃柱温，0.8、1.0、1.2mL/min 流速等色谱条件进行了考察， 最终确定各成分测定流速为1.0mL/min，柱温都为35℃。 实验结果表明本研究各方法方便快速、灵敏度高、专属性强，适合用于黄连解毒汤中盐酸小檗碱、黄芩苷、黄柏碱、栀子苷含量测定，为经典名方-黄连解毒汤开发及质量控制研究提供参考。