栀子饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒的HPLC 指纹图谱相关性研究

展 月，赵 俞，鄢必新，刘 鑫，徐 云，秦思莲，李生勇，王 鑫*

（1.吉林修正药业新药开发有限公司，长春130103；2. 修正药药业集团股份有限公司，通化134001）

栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis 的干燥成熟果实，味苦，性寒；归心、肺及三焦经；具有泻火除烦，清热利湿，凉血解毒；外用消肿止痛的功效；临床主要用于热病心烦，湿热黄疸，淋证涩痛，血热吐衄，目赤肿痛，火毒疮疡；外治扭挫伤痛等症。现代药理表明栀子中含多种化学成分，包括环烯醚萜苷类、三萜类、黄酮类、有机酸酯类等，其中山栀苷、栀子苷等环烯醚萜苷类成分为栀子的主要有效成分。 本研究采用HPLC 法，建立栀子饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒指纹图谱，评价其相关性，为栀子配方颗粒制备全过程的质量控制提供科学参考依据[1]。

1 材料

1.1 试剂

乙腈、甲酸为色谱纯；甲醇为分析纯；水为纯化水。

1.2 仪器

AE205DU 型分析天平 （上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-300DE 型数控超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；Ultimate 3000 高效液相色谱仪DAD 检测器。

1.3 试药

栀子饮片15 批（4 批购自江西临川批号：YC040-161010、YC009 -160904、YC009 -161008、YC009 -161009；3 批购自湖南平江：YC009-161005、YC009-161006、YC009-161007；4 批购自湖北宜昌：YC009-170411、YC009 -170412、YC009 -170413、YC009 -170414；4 批购自江西樟树：YC009-160901、YC009-160902、YC009-170416、YC009-170417）；栀子对照药材 （批号：120986-201309）； 栀子苷对照品 （批号：110749-201316）、 鸡矢藤次苷甲酯 （批号：110749-201316）、羟异栀子苷（批号：110749-201316）、Jasminoside B（批号：110749-201316）、京尼平-1-龙胆二糖苷（批号：110749-201316）、山栀子苷（批号：110749-201316）、苦藏花素（批号：110749-201316），购自中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 栀子片、标准汤剂、中间体、配方颗粒中栀子苷含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性[2-3]

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 以乙腈-水(15∶85 ) 为流动相，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，检测波长238nm，进样量10μL。 理论板数按栀子苷峰计算应不低于1500。

2.1.2 溶液制备

2.1.2.1 对照品溶液制备

取栀子苷对照品适量， 精密称定， 加甲醇制成每1ml 分别含30μg 的溶液，即得。

2.1.2.2 供品溶液制备

栀子饮片供试品溶液的制备同2020 《中国药典》栀子饮片项下方法，栀子标准汤剂、中间体、配方颗粒供试品制备方法: 取本品约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30 分钟，取出，放冷，再称定重量，再用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液3ml，置25ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.2.3 样品含量测定

结果见表1， 栀子饮片中栀子苷含量均大于1.5%，符合《中国药典》2020 年版一部 “栀子” 项下有关的各项规定。通过对15 批栀子饮片及其制备的标准汤剂冻干粉、中间体、成品栀子苷含量测定研究，栀子苷含量范围为12.0%～17.6%，平均含量为14.8%，中间体（干膏粉） 栀子苷含量范围为13.1%～17.6%， 平均含量为14.5%，配方颗粒栀子苷含量范围为9.1%～15.9%，平均含量为12.6%，

从表1 数据可发现栀子标准汤剂、中间体、配方颗粒，栀子苷含量相差小于±3，说明三者含量基本一致，栀子标准汤剂出膏率范围为19.1～29.0%，栀子苷转移率范围为57.0～85.2%，栀子中间体的浸膏收率范围为17.2～28.0%，栀子苷转移率范围为61.0～73.2%，均在栀子标准汤剂出膏率及栀子苷转移率范围之内， 说明栀子配方颗粒制备工艺合理， 因栀子配方颗粒在制备过程中加入辅料，故栀子苷含量较中间体低。

表1 栀子饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒中栀子苷含量

2.2 栀子饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒HPLC 指纹图谱的建立

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Kromasil 100-5-C18( 250mm×4.6 mm，5μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以0.5%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～10min，1%A→4%A；10～25min，4%A；25～50min，4%A→8%A；50～55min，8%A→10%A；55～65min，10%A→12%A；65～80min，12%A。 ） 流速为1ml/min； 检测波长为254nm； 柱温为35℃， 进样量：10μl。 理论板数按栀子苷峰计算应不低于1500。

2.2.2 参照物溶液制备

取山栀子苷、鸡矢藤次苷甲酯、羟异栀子苷、Jasminoside B、京尼平-1-龙胆二糖苷、栀子苷、苦藏花素适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml 分别含0.2mg的混合溶液，即得。取栀子对照药材约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30 分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 供试品溶液制备方法[4,5]

栀子饮片：取本品粉末（过四号筛）约0.3g，精密称定， 精密加甲醇50ml， 称定重量， 超声处理 （功率250W，频率40kHz）30 分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

栀子标准汤剂、配方颗粒、中间体：取本品约0.1g，精密称定， 置具塞锥形瓶中， 精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，取出，放冷，再称定重量，再用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液3ml，置25ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

取同一批栀子标准汤剂，按照2.2.3 项下条件制备供试品溶液连续进样6 次，记录色谱图，结果各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD＜3%， 表明精密度良好。

2.3.2 重复性试验

取同一批次栀子标准汤剂供试品6 份，按照2.2.3项下条件制备供试品溶液， 结果各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD＜3% ，表明重复性良好。

2.3.3 稳定性试验

取同一批次栀子标准汤剂样品，按2.2.3 项下制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24、48h 进样，结果各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD＜3%， 表明供试品溶液在48h 内稳定性良好。

2.4 样品的测定

取15 批栀子饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒供试品溶液10μL， 参照物溶液， 按照2.2.1 项下条件检测。 详见图1-4。

图1 栀子饮片HPLC 指纹图谱共有模式图

图2 栀子标准汤剂HPLC 指纹图谱及其对照指纹图谱

图3 栀子配方颗粒中间体HPLC 指纹图谱及其对照指纹图谱

图4 栀子配方颗粒HPLC 指纹图谱及其对照指纹图谱

2.5 共有峰标定

将15 批栀子饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒HPLC 指纹图谱数据导入 “中药色谱指纹图谱相似度评价系统”( 2012 版) 选择时间宽度为0.1，中位数法生成对照指纹图谱，经比较分析后确定栀子饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒均有9 个共有峰。 15 批栀子饮片、中间体、标准汤剂、配方颗粒指纹图谱相似度范围在0.9～1。 各批次供试品指纹图谱与对照图谱进行比较，计算其相似度，结果见表2。 结果显示，15 批饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均在0.9 以上，说明15 批不同产地的栀子饮片化学成分具有良好的相似性； 栀子配方颗粒生产工艺稳定。 与山栀子苷、鸡矢藤次苷甲酯、羟异栀子苷、Jasminoside B、京尼平-1-龙胆二糖苷、栀子苷、苦藏花素对照品色谱图进行对比，确认配方颗粒HPLC 指纹图谱中1 号峰为山栀子苷、2 号峰为鸡矢藤次苷甲酯、3 号峰为羟异栀子苷、4 号峰为Jasminoside B、5 号峰为京尼平-1-龙胆二糖苷、6 号峰为栀子苷7 号峰为苦藏花素；结果见图5。

表2 15 批栀子饮片、中间体、标准汤剂及配方颗粒的指纹图谱相似度

图5 共有峰指认

2.6 相关性分析

栀子饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒HPLC 对照指纹图谱比较结果见图6， 并采用相似度评价软件评价四者图谱的相似度，结果见表3，结果表明栀子配方颗粒的9 个共有特征峰在栀子标准汤剂、饮片、中间体中均有显示，由表3 可以看出栀子配方颗粒对照指纹图谱与饮片、标准汤剂、中间体的对照指纹图谱相似度在0.9 以上，结合15 批栀子饮片、中间体、标准汤剂、配方颗粒指纹图谱相似度范围在0.9～1，说明栀子配方颗粒和栀子饮片、中间体、标准汤剂成分一致，四者指纹图谱具有良好的相关性， 为采用HPLC 指纹图谱对栀子配方颗粒生产全过程进行控制提供试实验依据[6]。

表3 栀子饮片、标准汤剂、中间体、配方颗粒HPLC 对照指纹图谱相似度结果

图6 栀子饮片(1) 、标准汤剂(2) 、中间体(3) 及配方颗粒(4) 的HPLC 对照指纹图谱比较