HPLC法测定人参茎叶中5种人参单体皂苷

李健豪，谢丽娟，于 晶，冯慧柳，宋莹莹，郭畅冰，初赛君，董亚南，徐芳菲*

(吉林人参研究院·吉林 通化·134001)

人参（Panax ginseng C.A.Mey）[1]，为五加科多年生草本植物人参的干燥根，为我国传统名贵中草药，有“百草之王”的美誉[2]，人参近多年来已被广泛应用于食品、药品、保健品等多种领域，其主要化学成分为人参皂苷，人参皂苷按构型主要分为二醇型与三醇型两大类[3]，除此外人参中还含有多糖、氨基酸、黄酮以及各种微量元素等多种化学成分[4-6]。有实验研究表明人参皂苷Rb1干预下能够减少乳酸的分泌显著提高血清肌酸激酶的恢复从而提小鼠的耐受能力[5]，同时人参皂苷Re对药源性所引起的肝肾损伤存在一定的缓解作用[7]，也有研究报道人参皂苷提取物能够促进提升中性粒细胞和淋巴细胞的功能，恢复中老年人非特异性和淋巴细胞介导的特异性防御功能[8]，然而大量研究报道均集中于人参根，以往对人参其他非药用部位的成分研究却鲜有报道，近几年来国内外学者对人参化学成分的研究逐渐向非药用部位拓展，有研究表明人参花蕾和人参茎叶中的部分皂苷的含量远远高于人参根中，同时人参茎叶的市场价格与人参根相比较为低廉，性价比更高，且茎叶中所含叶绿素和纤维性成分更为丰富，吉林省作为人参道地主产区，年产量约达3万余吨，本课题组已对人参非要用部位进行过初期探究，研究发现人参茎叶中主要含有5种人参皂苷（Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd）含量与人参根种具明显差异。本文旨在通过实验摸索出一种同时检测人参茎叶中5种人参皂苷（Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd）准确、快速、稳定检测方法，为人参非要传统用部位日后的研究提供理论依据，也对将来的进一步分离人参茎叶中单体皂苷进行试验基础。

图1 人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd的结构式

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

10批次人参茎叶：分别采购自吉林集安，经吉林人参研究院徐芳菲高级工程师鉴定为人参地上部分的干燥茎叶。乙醇、乙醚、正丁醇：（分析纯）北京化工厂；甲醇、乙腈为色谱纯（Fisher，USA）；超纯水为实验室自制；人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd对照品均购自中国食品药品检定研究院。

SQP电子天平：赛多利斯（上海）贸易有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣仪器有限公司；DLSB-5/20低温冷却液循环泵：上海振捷仪器设备有限公司；Agilent1260高效液相色谱仪、色谱柱（ZORBAX SB-C18250mm×4.6mm，5μm）。

1.2 方法

1.2.1 供试品溶液的制备

分别取10批人参茎叶样品于烘箱中55℃烘干，粉碎，过60目筛。精密称取人参茎叶试样粉末各1g，加50mL80%乙醇加热回流1.5h，反复提取3次，合并滤液，蒸干。残渣加10mL水溶解并转移至分液漏斗中，再加30mL水饱和正丁醇萃取，重复萃取5次，合并正丁醇萃取液，蒸干。残渣加甲醇溶解并转移至5mL容量瓶中，为待测液，备用。

1.2.2 对照品溶液的制备

精密称取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd对照品各2mg，加甲醇定溶至10 mL，配置成各含0.2 mg/mL混合对照品溶液，摇匀，即得。

1.2.3 HPLC检测条件

色谱柱ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），进样量20 μL，柱温33℃，流速1 mL/min，检测波长203 nm，流动相：乙腈（A）-水（B）梯度洗脱，0~35 min，19 %（A）81 %（B），35 min~50 min，19%~29%（A）81%~71%（B），50 min~70 min，29%（A）71%（B），70 min~80 min，29%~35%（A）71%~65%（B），80 min~100 min，35%~40%（A）65%~60%（B）；将供试品及对照品溶液分别进入HPLC进行检测。

1.2.4 线性关系考察实验

精密吸取对照品溶液，分别稀释成不同梯度的6种浓度，分别进入HPLC，计录色谱峰面积，横坐标（X）为进样质量（μg）、纵坐标（Y）为对应的峰面积，并对上述5种人参皂苷的对照品的标准曲线进行绘制。

1.2.5 精密度实验

取对照品溶液中5种标准品任一浓度，按照“1.2.3”中色谱条件吸取20μL，进行HPLC分析，重复进样6次，分别记录峰面积的变化情况，计算RSD值。

1.2.6 重现性实验

取同一批次样品，分别取样6份，采用“1.2.1”方法平行制备6个供试品溶液，分别根据“1.2.3”中色谱条件，进行HPLC分析测定，计算样品中5种人参皂苷的含量及RSD值

1.2.7 稳定性实验

按“1.2.1”方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12、24、48h时间段进样，记录5种人参皂苷的峰面积，计算含量及RSD值。

1.2.8 加样回收率实验

精密称取人参茎叶试样粉各末1g，共6份，均分别加入上述5种人参皂苷对照品各0.5mg（0.2 mg/mL，2.5mL），按照“1.2.1”处理方法进行供试品制备，利用HPLC分析，计算回收率及RSD值。

2 结果与分析

2.1 样品含量测定结果

对5种人参皂苷标准品进行HPLC检测，由图2可见，其分离度良好，同时，由表1可知10批次人参茎叶中5种人参皂苷含量，不难看出人参茎叶中人参皂苷Rg1、Re、Rd含量较为突出，人参皂苷Rb1、Rc的含量较低。

图2 人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd标准样品

表1 人参茎叶中5种人参皂苷成分的含量（mg/g）

2.2 方法学结果

2.2.1 线性关系

结果表明，5种人参皂苷的标准曲线如表2所示，分别得到Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd 5种人参皂苷的线性关系，R2≥0.9992。

表2 5种人参皂苷的标准曲线及相关系数

2.2.2 精密度

分别测得5种人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd峰面积的RSD值（n=6）分别为0.46%、0.57%、0.61%、0.59%、0.67%，表明此方法精密度良好。

2.2.3 重现性

表3充分显示，人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd的含量平均值分别为5.382mg/g、11.364 mg/g、0.623 mg/g、1.772mg/g、6.329mg/g，RSD值 在1.57%～2.27%之间，表明该方法重现性良好。

表3 5种人参皂苷重线性

2.2.4 稳定性

经实验结果得出5种人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd峰面积的RSD值别为0.51%、0.53%、0.49%、0.72%、0.64%表明供试品溶液在0～48 h内趋于稳定，其稳定性较为良好。

2.2.5 加样回收率

5种人参皂苷对照品加样回收率值分别为Rg1：75.2%～84.6%、Re：65.7%～79.6%、Rb1：74.7%～89.6%、Rc：67.3%～78.4%、Rd：72.8.2%～82.9%，平均回收率RSD值均＜3%（n=6）。

其方法学验证结果充分表明该方法可用于人参茎叶中5种人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd的含量测定，其方法快速准确，稳定性良好。?

人参茎叶作为人参非传统药用部位，其主要成分中皂苷种类与人参相差无几，但部分皂苷含量有区别于人参，其中人参皂苷Rd尤为明显。人参皂苷Rd能够通过抑制Caspase-3的活化，增加Akt和GSK-3β磷酸化，提高Bcl-2/Bax的比值继而达到抑制细胞凋亡保护心肌的作用，其良好的生物活性，有待对其分离纯化的工艺进行更深入的研究。同时，人参茎叶同产的不同批次中5种人参皂苷含量存在一定的差异，其原因是否与其采收时间，生长环境，抑或者是其种质资源的差异性不同而导致，都需进一步探讨。本研究对人参茎叶中5种人参单体皂苷（Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd）含量进行了分析，建立了一个快速、准确、重复性较好的人参茎叶多种皂苷类成分的定量检测方法旨在为更好地控制人参茎叶的质量，多方面开发人参茎叶的食药价值提供理论和实验基础，希望更多的专家学者对人参非传统药用部位进行多元化、全方面的开发利用，加速推动人参产业更快更好的发展。