正交试验法提取细叶景天中黄酮类成分的研究

杨若熙，谭惠能，吴仕筠，翁德会*

（1.武汉华夏理工学院生物与制药工程学院，武汉430223；2.武汉工商学院环境与生物工程学院，武汉430074）

细叶景天（Sedum Elatinoides Franch.）为景天科景天属，多年生肉质草本，株高30～40cm。根状茎长，匍匐状。叶绒状匙形，宽0.3～0.5 cm。花序不呈平顶或稍平顶，花黄色，生于海拔2350～3400 m的山坡石隙,耐寒，耐干旱，喜阳光充足。四川、湖北、陕西、甘肃和山西有分布。在我国民间及多个少数民族地区以其作药用。全草药用，清热解毒，治痢疾。有文献报道，景天属植物中含有黄酮类化合物[1-2]。但是关于细叶景天中黄酮类成分研究尚未见报道。为了开发利用这一药用植物资源，本实验对细叶景天中黄酮类成分的提取工艺进行了研究，希望获得最佳提取工艺，为细叶景天中黄酮成分提取工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

细叶景天，产地：湖北建始县，由中南民族大学生命科学学院万定荣老师鉴定并提供；无水乙醇，分析纯（AR），天津市凯通化学试剂有限公司；95%乙醇，分析纯（AR），天津市凯通化学试剂有限公司；甲醇，分析纯（AR），天津市凯通化学试剂有限公司；亚硝酸钠，分析纯（AR），天津市河北区海晶精细化工厂；氢氧化钠，分析纯（AR），天津市凯通化学试剂有限公司；硝酸铝，分析纯（AR），天津市凯通化学试剂有限公司；芦丁对照品（纯度98%，批号：150403），天津一方科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

756型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；KQ-100E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SHB-III循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；Auy-120型1/10000电子天平，日本岛津公司；微量可调移液器，100～1000 μl。

1.3 实验方法

参照文献[3-5]以芦丁为对照品测定细叶景天中总黄酮含量，加入铝离子试剂,同时控制适宜pH值,使黄酮类化合物与铝盐形成络合物在可见区能获得稳定的特征吸收峰。

1.3.1 标准品溶液的制备

精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁标准品0.0125 g，用甲醇适量，置水浴上微热溶解，放冷，转移至25 ml量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，制成浓度为0.500 mg/ml的芦丁标准溶液。准确量取20 ml，置50 ml量瓶中，加水定容至50 ml，制成浓度为0.200 mg/ml的芦丁标准溶液。

1.3.2 测定波长的选择

移取浓度为0.200 mg/ml的芦丁标准溶液3.0 ml，置于25 ml量瓶中，加水至6 ml，加5%亚硝酸钠溶液1 ml，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 ml，摇匀，放置6 min，加1 mol/L氢氧化钠溶液10 ml，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，进行全波长扫描，测定其最大吸收。

1.3.3 标准曲线制作

准确移取芦丁标准溶液1、2、3、4、5、6 ml，分别置于25 ml量瓶中，按1.3.2法操作，以相应试剂为空白，用紫外-可见分光光度法，在499 nm的波长处测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.4 正交单因素实验

1.3.4.1 料液比单因素实验

准确称取2.00 g已粉碎的细叶景天粉末5份于5个100 ml的烧杯中，按超声时间30 min，乙醇提取浓度50%，料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30进行提取，纱布过滤，离心6000 r/min，15 min，分别取上清液1 ml，按1.3.2法操作，于499 nm处测定其吸光度值，通过标准曲线，计算出总黄酮含量（以干燥品计）[6-8]。

1.3.4.2 乙醇浓度单因素

准确称取2.00 g已粉碎的细叶景天粉末5份于5个100 ml的烧杯中，按料液比1∶20，超声时间30 min，乙醇提取液浓度分别为40%，50%，60%，70%，80%进行提取，纱布过滤，离心6000 r/min，15 min，分别取上清液1 ml，按1.3.2法操作，于499 nm处测定其吸光度值，通过标准曲线计算出总黄酮含量（以干燥品计）。

1.3.4.3 超声波时间单因素实验

准确称取2.00 g已粉碎的细叶景天粉末5份于5个100 ml的烧中，按料液比1∶20，乙醇提取浓度50%，超声时间15、20、25、30、35 min进行提取，纱布过滤，离心6000 r/min，15 min，分别取上清液1 ml，按1.3.2法操作，于499 nm处测定其吸光度值，通过标准曲线计算出总黄酮含量（以干燥品计）。

1.3.5 四因素三水平正交试验

为系统考察超声波乙醇浸提法提取细叶景天中黄酮类成分的工艺参数，根据已有资料和单因素实验，选用乙醇浓度、超声时间和料液比作为考察因素，以测得样品中黄酮含量为考察指标。进行L9（34）正交实验[9-12]。

1.3.6 含量测定的方法学考查

1.3.6.1 精密度试验

分别精密吸取芦丁标准品溶液1.0 ml于6只25 ml的容量瓶中，按1.3.2法操作，在499 nm处测定其吸光度值，通过标准曲线计算出总黄酮含量（以干燥品计），并计算RSD%。

1.3.6.2 稳定性试验

取样品溶液，于选定波长499 nm处，按1.3.2法操作，测定显色5、10、15、20、25 min的A值，以干燥品计，得出总黄酮的含量，并计算RSD%。

1.3.6.3 回收率实验

在已知黄酮含量的样品溶液中精密加入由低到高的不同浓度的标准品，即分别取样品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml置于25 ml的量瓶中，再各加入0.200 mg/ml的芦丁标准品1.0 ml。按1.3.2法操作，以干燥品计，计算回收率和RSD%。

1.3.7 最佳工艺验证实验

准确称取已粉碎的细叶景天2.00 g四份，分别按照最佳提取条件制备样品，按1.3.2法操作，以干燥品计，计算黄酮的含量，并计算RSD%。

2 实验结果与分析

2.1 测定波长的选择

按照1.3.2方法操作，测定其最大吸收。结果表明：芦丁在499nm处有一较大吸收峰，故选499nm为测定波长。

2.2 标准曲线制作

按照标准曲线制作方法操作，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线,得出回归方程和r值。芦丁标准品回归方程图详见表1、图1。

图1 芦丁标准曲线回归方程图

表1 芦丁标准曲线

结果表明，回归方程A=0.011C,相关系数r=0.9992，表明芦丁浓度在0.8～0.48 μg/ml的范围内线性关系良好。

2.3 正交单因素实验

2.3.1 料液比单因素实验

按上述方法操作，于499 nm处测定其吸光度值，通过标准曲线，计算出总黄酮含量（以干燥品计）。

其中V=1 ml，k=0.011，n1=20，n2=30，n3=40，n4=50，n5=60分别代入A值计算可得含量。结果见表2、图2。

表2 料液比单因素

图2 料液比单因素

由表2、图2可见，浸提固液比在l∶10至1∶30的范围内，浸提料液比在l∶20时提取率最高，但随后增加溶剂的量对提取率的变化不大.因此选取料液比为1∶15、1∶20、1∶25进行正交试验。

2.3.2 乙醇浓度单因素

按上述方法操作，于499nm处测定其吸光度值，通过标准曲线计算出总黄酮含量（以干燥品计）。

其中V=1 ml，k=0.011，分别代入A值计算可得含量。结果见表3、图3。

表3 乙醇浓度单因素

图3 乙醇浓度单因素

由表3、图3可见，随着乙醇浓度的增加，黄酮的提取率也逐渐增加，但是当乙醇浓度超过50%的时候，黄酮的提取率反而降低，所以选择乙醇浓度40%、50%、60%进行正交试验。

2.3.3 超声波时间单因素实验

按上述方法操作，于499 nm处测定其吸光度值，通过标准曲线计算出总黄酮含量（以干燥品计）。

其中V=1ml，k=0.011，分别代入A值计算可得含量。结果见表4、图4。

表4 超声时间单因素

图4 超声时间单因素

由表4、图4可以看出，随超声波提取时间从10～35 min，提取得率逐渐提高，增加超声波提取时间，提取得率逐渐提高，因此选取超声时间为30、35、40 min进行正交试验。

2.4 四因素三水平正交试验

L9（34）正交实验因素水平设计如表5所示。

表5 L9（34）正交试验因素设计水平

准确称取2.00g已粉碎的细叶景天粉末9份于9个100 ml的烧中，按表5及表6进行浸提，离心6000 r/min，15 min，分别取上清液1 ml，按1.3.2法操作，于499 nm处测定其吸光度值，通过标准曲线，以干燥品计，得出总黄酮含量(考虑到实际吸光度大于1，可以将所配溶液稀释2倍)。

其中V=1 ml，k=0.011，n=30、40、50分别代入A值计算可得含量。结果见表6、表7。

表6 正交试验方案及结果分析

表7 方差分析表

F临界值 F0.01(2,2)=99 F0.05(2,2)=19

通过正交试验和方差分析考虑A、B、C、D四因素在三个水平上的变化，可知A（乙醇浓度）、B（超声时间）、D（料液比）因素的影响均无显著性差异。因此得出影响细叶景天中黄酮类化合物提取率的因素主次顺序为B＞D＞A＞C，从平均提取得率看，提取条件A3B3C3D2,最好，所以选择A3B3C3D2，即乙醇浓度为60%，超声时间为40 min，料液比为1∶20。

2.5 含量测定的方法学考查

2.5.1 精密度试验

精密度实验结果见表8。

表8 精密度考察结果

表8结果表明，RSD=2.96%，表明此实验所用仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验

稳定性实验结果见表9。

表9 稳定性实验结果

表9结果表明，RSD=2.29%，表明此样品在25min内有良好的稳定性。

2.5.3 回收率实验

回收率实验结果见表10。

表10 回收率测定结果

表10结果表明，平均回收率为71.35%，RSD=2.13%，回收率结果稍微偏低。

2.6 最佳提取工艺验证实验

按最佳提取工艺操作，以干燥品计，计算黄酮的含量，并计算RSD%。结果见表11。

表11 验证实验结果

由表11结果表明，标准偏差为0.3431，RSD=0.6567%，表明此提取工艺有良好的重现性。

3 结论

正交试验结果表明，采用超声波乙醇浸提法提取细叶景天中总黄酮成分，影响细叶景天中黄酮成分提取条件的因素主次顺序为B＞D＞A＞C，最佳提取工艺条件为乙醇浓度60%，超声时间40 min，料液比1∶20。本提取工艺条件稳定、简单、黄酮的得率高，可行。

3.1 回收率实验的讨论

在样品的回收率试验中，回收率结果稍微偏低，可能的原因有以下几点：a.本实验的样品是中药材，并且成分比较复杂，目标成分损失较大；b.在提取过程中由于操作误差，导致目标成分有所损失。

3.2 提取方法的讨论

利用超声波乙醇浸提法从细叶景天中提取、纯化得到的黄酮类物质（以芦丁为指标）其纯度较高。超声波可以强化乙醇浸提法，达到省时、高效、节能的目的，此方法采用全物理过程，无任何污染，是一条理想的提取黄酮类物质的途径，具有广阔的应用前景。

3.3 实验材料的选择

由于细叶景天中活性物质的含量与产地、气候、栽培条件有很大关系,故不同品种、不同时期、不同部位（根、茎、叶等）中黄酮类物质含量可能会有一些差别,至于差别的大小还有待于进一步研究分析。

3.4 应用前景及实验意义

近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点倍受青睐，而黄酮类化合物以其广谱的药理作用引人瞩目。本文实验结果表明，细叶景天中含有较为丰富的黄酮类物质。因此，具有广泛的开发和利用价值。