基于网络药理学探究百合治疗肺癌的作用机制

王森森，周林峰，鲍慧玮，田 健*

(长春中医药大学·吉林 长春·130117)

中国是世界上肺癌负担重的国家之一，占全球肺癌病例总数的23.7%，死亡人数为30%，在中国肺癌发病率与死亡率均位于恶性肿瘤的首位[1]。

传统中医认为肺为华盖，主气，司呼吸，与外界空气相连，容易受到外界六害的攻击[2]。更容易受到空气中漂浮物和粉末的攻击。肺主皮毛是人体抵抗外部邪恶的最大器官，所以它很容易受到风、冷的侵袭。热、湿、燥、火的邪侵，影响肺的宣泄功能，导致肺气不良，气血循环衰竭通常，痰会积聚并形成肿块。吸烟也是肺癌的重要致病因素。毒性辛辣、干燥，易耗气、伤阴、损肺络，导致气血疲乏，并衍生痰淤阻肺络。毒物来到体内随之流通。肺癌患者肺、脾、肾虚损，多选用补益肺肾的药物，佐以健脾益气。中医治疗肺癌以“祛邪扶正”为基本原则，并且要权衡“养正积自除”及“邪祛则正安”的关系[3]。

百合始载于本草著作《神农本草经》，味甘，平[4]。具有清心安神、养阴润肺的功效。常用于阴虚燥咳，虚烦惊悸，失眠多梦[5]，是最具代表性“药食同源”中药材之一。百合含有甾体皂苷、甾醇、酚酸、黄酮、生物碱、多糖等成分。现代药理发现百合具有止咳化痰、抗炎、抗肿瘤、增强自身免疫力等作用[6-7]。虽然也有百合治疗肺癌的研究报道，但是目前对于百合治疗肺癌的药效物质基础和作用机制尚不明确，因而限制了其进一步的临床研究。本文应用网络药理学技术以分析百合治疗肺癌的经验，并期望通过此研究，提出诊治肺癌的核心成分与靶点，对中医药治疗肺癌提供了有利依据。

1 资料与方法

1.1 百合的活性成分及其作用靶点的筛选

使用中药数据库药理平台（TCMSP）（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）按口服利用度OB%≥20且类药性DL≥0.10的标准筛选出百合的有效活性化合物以及对应作用靶点。再从Uniprot（https://www.uniprot.org/）数据库中智人选项中的化合物数据库找出对应靶点的基因名称。

1.2 肺癌疾病靶点的获取

以lung cancer为关键词，分别从Genecards（https://www.genecards.org/）、Disgnet（https://www.disgenet.org/）找出疾病的靶点，建立肺癌疾病相关靶点数据库，去除重复基因。

1.3 药物与疾病共同靶点的筛选与蛋白质相互作用网络的构建

将从两个疾病数据库中得到的肺癌靶点与TCMSP中获得的药物靶点进行比对，使用Venn2.1.0（http://bioinformatics.psb.ugent.be/cgi-bin/liste/Venn/calculate_venn.htpl）对百合预测靶点与肺癌相关靶点进行交集并百合抗肺癌的基因靶点数据库；筛选疾病与药物的共同靶点并将共同靶点导入String(https://string-db.org/，Version 11.0)，物种选择智人，获取靶点相互作用网络，导入Cytoscape 3.7.0软件进行PPI网络图的构建。

1.4 药物-有效成分-靶点网络图的构建

利用百合与肺癌交集靶点反向筛选有效成分，利用Ctoscape3.7.0构建药物-有效成分-靶点网络图，进行网络度互作分析，从中分析百合治疗肺癌的潜在物质基础。

1.5 GO功能及KEGG通路富集分析

将百合抗肺癌的作用靶点上传到Metascape（metascape.org）数据平台，进行GO分子功能（GO Molecular Functions）、GO生 物 过 程 （GO Biological Processes）、GO细胞组分（GO Cellular Components）和KEGG通路富集分析。利用微生信数据可视化网站（www.bioinformatics.com.cn/）分别制作GO和KEGG富集气泡图及三合一条形图。

2 结果

2.1 百合活性成分筛选结果

通过TCMSP中药系统药理学数据库分析平台以口服利用度OB≥20%且类药性DL≥0.10为条件筛选得到百合16个化合物。其中百合的主要有效成分详见表1。

表1 百合的活性成分

2.2 百合治疗肺癌疾病靶点的收集

以lung cancer为关键词，分别在Genecards（https://www.genecards.org/）、Disgnet（https://www.disgenet.org/）数据库中进行检索获取肺癌的相关疾病靶点。两个数据库汇总去重后共获得5702个疾病靶点，与药物做交集得到57个重复靶点。利用Draw Venn diagrams （http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）将肺癌疾病靶点与百合药物靶点导入，制作Venn图（见图1）。

图1 药物和疾病Venn图

2.3 PPI网络图的构建、核心靶点筛选

将57个靶蛋白导入STRING数据库分析后得到蛋白质相互作用关系,利用Cytoscape 3.7.0软件构建蛋白质相互作用关系网络见图2。将网络中靶点的大小按照其网络度排列，有效成分的靶点数越多其网络度越大，图2中黄色靶点在靶点互作分析中网络度较高，可能是百合治疗肺癌关键靶点。

图2 百合抗肺癌ppi网络图

表2 ppi网路图中核心蛋白靶点

2.4 药物-有效化合物-靶点网络图

利用百合与肺癌57交集靶点反向筛选有效成分，利用软件tool中Network Analyzer功能对所有有效化合物进行degree值排序。其中degree值较大的四个成分是西多糖苷、大黄素、β-谷甾醇和豆甾醇。这四种化合物可能为百合治疗肺癌的关键化合物（图3）。

图3 药物-有效成分-疾病靶点图

2.5 GO富集分析及KEGG通路富集分析

在Metascape基因富集分析网站（metascape.org）中将潜在作用靶点导入，对百合抗肺癌的潜在靶点57个进行GO基因富集分析和KEGG靶点通路注释分析。在智人数据库中分别进行KEGG通路富集分析、GO生物过程（GO Biological Processes）、GO细胞组分（GO Cellular Components）以及GO分子功能（GO Molecular Functions）。其中在GO Molecular Functions富集分析中共得到109条功能条目，在GO Biological Processes富集分析中共得到815条功能条目，KEGG通路富集分析共获得140条信号通路，在GO Cellular Components富集分析中共得到40条功能条目。列出显著性最高的十条（图4~6）。生物学过程主要涉及细胞对有机环状化合物的反应、对激素的反应、MAPK级联调节、蛋白质磷酸化的正调节、细胞迁移的正向调节、细胞运动的正向调节等；细胞组分主要富集与线粒体包膜、线粒体膜、枝晶、树突树、突触后等，可能作用于线粒体发挥作用。分子功能主要富集于蛋白质结构域特异性结合、转录因子结合、蛋白激酶活性、磷酸转移酶活性，醇基作为受体、激酶活性、DNA结合转录因子结合等。KEGG结果表明百合可能作用于p53信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路、TNF信号通路等来发挥抗肺癌的作用。

图4 三合一柱状

图5 KEGG富集结果气泡图

图6 多分类GO，Pathway富集结果气泡图

3 讨论

肺癌（Lung cancer）是临床发病率和病死率最高的恶性肿瘤，根据肿瘤起源的分类，它起源于肺的节段性支气管[8]。化疗是目前治疗肺癌的主要手段之一，但化疗药物多为细胞毒性药物，患者常因严重的不良反应拒绝化疗。有一定局限性，且伴随各种不良反应，患者往往不能耐受导致依从性差而减量、停药甚或中止治疗[9]。目前，中医药治疗包括癌症在内的多种疾病的前景已引起全球关注。中草药中的许多生物活性成分显示出较强的抗癌能力和较少的毒副作用[10]。周洁[11]从细胞和动物两个方面证实，以百合为主的复方可以抑制肺癌细胞的活性和增殖，干扰体外克隆的形成，并显著减少体内肿瘤的生长。此外，实验进一步揭示了以百合为主的复方通过诱导细胞周期阻滞和凋亡来杀死肺癌细胞。罗林明[12]研究结果显示百合总皂苷对肺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭具有抑制作用，并且对细胞凋亡具有诱导作用。百合总皂苷可通过下调PCNA的表达抑制肺癌细胞DNA合成，从而抑制细胞增殖。百合总皂苷对肺癌细胞凋亡的诱导作用与其对Bcl-2，Bax蛋白的表达调控有关。

在TCMSP共筛选到百合16个有效化合物和80个预测靶点，肺癌相关基因靶点共5702个，对预测靶点与肺癌疾病靶点进行对比分析，得到57个共同靶点。通过构建药物-有效成分-通路-靶点网络图，Degree值排名靠前的是西多糖苷、大黄素、β-谷甾醇，豆甾醇。这四种化合物可能为百合治疗肺癌的关键化合物。大黄素对A549细胞有良好的杀伤作用，且呈浓度依赖性。大黄素可诱导A549细胞凋亡，大黄素处理A549细胞后，AKT和Bcl－2的p-表达显著降低，Bad、cleaved-caspas-3的表达水平显著升高。大黄素通过调节信号转导途径诱导人肺癌A549细胞凋亡[13]。研究[14]表明，豆甾醇能通过上调促凋亡基因表达(Bax蛋白、p53基因)、下调抗凋亡基因Bcl-2表达、激活有助细胞凋亡的caspase-8，9蛋白表达，并通过损伤细胞DNA，从而诱导Hep G2细胞凋亡，可作为抗肺癌的潜在成分。所以药物-有效成分-通路-靶点网络图中Degree值排名较高的有效化合物的药理作用与现有的药物药理学研究观点基本一致，因此，来自网络的数据对这些有效化合物具有一定的准确性基础，可为进一步研究百合治疗肺癌的药效物质提供新的预测和研究方向参考。

通过构建蛋白相互作用网络，利用软件Network-Analyzer功能对靶点进行degree值排序，通过degree值的大小筛选出degree值最高的核心靶点，分别为TNF、TP53、MYC、JUN、ESR1。目前TNF研究较多，查艳梅[15]等在宣威肺癌患者血清及细胞中发现TNF-α显著性高表达，差异均有统计学意义(P＜0.05)。沉默TNF-α不仅阻滞细胞周期、抑制细胞增殖及迁移，并促进凋亡(P＜0.05)，也抑制NF-κB经典信号通路。TP53是细胞内一种重要的肿瘤抑制基因，它是包括肺腺癌、肺鳞癌在内的多种不同类型肿瘤中突变频率最高（＞50%）的基因。作为“基因组的守护者”，它是细胞生长周期的负调节因子，与细胞周期的调控，细胞凋亡、分化，DNA修复等生物学功能有关[16]。

通过GO富集分析以及KEGG通路富集分析，百合治疗肺癌涉及到通路有p53信号通路、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、MAPK信号通路、NF-kappa B信号通路、Wnt信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路、JAK-STAT信号通路、VEGF信号通路。MAPK信号途径作为细胞增殖、分化、凋亡、黏附和迁移等胞内信号传导的重要通路之一，其异常激活也是引发肺癌化疗、靶向、免疫等治疗药物产生耐药的关键所在，并有望成为逆转肺癌耐药新的干预靶点[17]。综上所述，本篇文章利用网络药理学探究了百合治疗肺癌的活性成分，结果表明百合中西多糖苷、大黄素、β-谷甾醇，豆甾醇等活性成分，这些活性成分可能作用于PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路等来抑制炎性反应、免疫调节、细胞凋亡等，进而发挥抗肺癌作用。

本文采用网络药理学方法探索百合治疗肺癌死潜在作用机制，相关结果表示百合可通过多靶点、多通路治疗疾病，为新药开发提供一定基础。