消风止痒颗粒中防风薄层鉴别优化

庞 威，樊 杰，孙继泽，王艳娟，林禹欣，郭英侠，鲁玉娇，闫胜楠，纪天一，李 坤，赵理鹏，隋国奇

（吉林紫鑫药业股份有限公司·吉林 通化·134000）

消风止痒颗粒现行质量标准收载于《部颁标准》中药成方制剂第十五册，标准编号：WS3-B-2975-98，处方中包括防风、蝉蜕、地骨皮、苍术（炒）、亚麻子、当归、地黄、木通、荆芥、石膏和甘草十一味药材。防风为方中君药，是伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata(Furcz.)Schischk的干燥根，辛、甘，微温。归膀胱、肝、脾经。具有祛风解表，胜湿止痛，止痉的功效。用于感冒头痛，风湿痹痛，风疹瘙痒，破伤风[1]。主要化学成分包括色原酮、香豆素、多糖以及挥发油等[2]。其中，色原酮是其主要活性成分，包括3'-O-当归酰亥茅酚、3'-O-乙酰亥茅酚、亥茅酚、亥茅酚苷、5-O-甲基维斯阿米醇、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素苷等[3-4]。

原标准中收载了防风的薄层色谱鉴别项，但方法中未明确规定溶媒量、滤液浓缩体积、对照药材取样量及点样量等参数，而且供试品溶液的制备存在黏度大、点样困难等问题。优化后的方法可靠，易于操作，可作为消风止痒颗粒中防风薄层鉴别项的质量标准。

1 仪器与试药

1.1 供试品

消风止痒颗粒：吉林省紫鑫药业有限公司，批号：E190104、E190110、E190117、E190124、E190130、E190136、E190142、E190148、E190154、E190160。

1.2 对照品及对照药材

防风对照药材，批号：120947-201409，升麻素苷对照品，批号：111522－201712；5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品，批号：111523－201610，中国食品药品检定研究院。

1.3 试剂与仪器

紫外可见投射反射仪WFH-201BJ，上海精科实业有限公司；电子天平YP1201，1/10，上海良平仪器仪表有限公司；电子天平SQP，1/10000，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；甲醇、正丁醇、氨水、丙酮、乙醇等试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 现行标准方法

取本品5g,加乙醇适量,加热取5分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至适量作为供试品溶液;另取防风对照药材,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验,取供试品溶液、对照药材溶液分别点于同一含羧甲基纤维素钠粘合剂的硅胶G薄层板上,以氯仿-醋酸乙酯(15∶4)为展开剂展开,取出,晾干,置紫外光灯(365nm)下检视。

2.2 消风止痒颗粒中防风薄层鉴别改进方法试验

2.2.1 薄层色谱条件以三氯甲烷-丙酮-甲醇（4∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，挥干。

2.2.2 供试品溶液制备

取本品10g，研细，加水30ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的氨试液50ml洗涤，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

2.2.3 对照品溶液制备

取升麻素苷对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品，加乙醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。

2.2.4 对照药材溶液制备

原位杂交结果显示，在结肠癌组织中，miR-454-3p的表达水平显著高于正常结肠组织。我们对原位杂交结果进行统计分析，分别取了5个高倍视野，计算了miR-454-3p阳性细胞数占总细胞数的比例，结果显示，结肠癌组织中的miR-454-3p表达水平显著高于正常结肠组织中的表达水平组间差异显著（P＜0.05，图1）。

取防风对照药材0.5g，加丙酮30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。

2.2.5 鉴别试验

按照薄层色谱法（《中国药典》2020年版四部通则0502）试验，吸取供试品溶液10μl、对照药材溶液6μl及对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，按照2.2.1项下薄层色谱条件进行，置紫外光灯（365nm）下检视。

结果显示：供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。且阴性对照溶液在相应的位置无干扰，详见图1。

图1 优化后防风TLC图谱

2.3 薄层色谱条件的确定

2.3.1 供试品溶液制备方法

本次研究共筛选了5个供试品溶液制备方法，包括乙醇回流提取法、乙醇超声提取法、丙酮超声提取法、水溶解后乙醚-乙酸乙酯-水饱和正丁醇分段萃取法、水溶解后水饱和正丁醇萃取法。因本品含糖量较多，采用乙醇和丙酮直接提取法制备的供试品溶液存在粘度大、点样量少、斑点显现不清晰等问题，而采用萃取法，可以很大程度的避免上述问题，且随着溶剂极性的增加，提取的物质亦增多，同时考虑到方法的简便、快捷及可操作性，最终选择了水溶解后水饱和正丁醇萃取法作为防风薄层鉴别的供试品溶液制备方法。

2.3.2 展开剂的筛选

根据确定的供试品溶液制备方法，筛选了如下展开系统：①三氯甲烷-甲醇（4∶1）；②三氯甲烷-丙酮-甲醇（4∶1∶1）；③三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置的下层溶液。

结果：展开剂①和③分离效果不理想，阴性干扰；展开剂②分离效果好，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。与此同时，我们对供试品取样量（10、15、20g）和点样量（6、8、10μl）进行了筛选，最终确定供试品的取样量为10g，点样量为10μl。详见图2、3。

图2 防风鉴别取样量考察TLC图谱

图3 防风鉴别点样量考察TLC图谱

2.4 专属性实验

按照标准正文方法制备供试品溶液 （批号：E190104、E190110、E190117）、对照药材溶液、对照品溶液及阴性供试品溶液，并根据展开剂②的方法进行点样、展开、显色、检视。结果：3批供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰，详见图1。

2.5 耐用性实验

2.5.1 点样方式考察

取供试品溶液按照标准正文项下方法进行试验，考察条带状和圆点状点样方式对薄层色谱行为的影响。结果：按照上述不同点样方式进行试验，供试品色谱中目标斑点分离效果均较好，无明显变化，详见图1、4。

图4 耐用性考察试验（圆形点样）TLC图谱

2.5.2 不同厂家薄层板考察

考察了三个不同生产厂家薄层预制板：①青岛海洋化工有限公司（批号：20180312）；②青岛海洋化工厂分厂（批号：20171225）；③青岛鼎康硅胶有限公司（批号：20160322）。结果：经三种不同厂家生产的薄层预制板对比试验，供试品色谱中目标斑点分离效果均较好，详见图1（青岛海洋化工有限公司）、图5（青岛海洋化工厂分厂）、图6（青岛鼎康硅胶有限公司）。

图5 不同厂家薄层板考察TLC图谱（青岛海洋化工厂分厂）

图6 不同厂家薄层板考察TLC图谱（青岛鼎康硅胶有限公司）

2.5.3 温湿度条件考察

取供试品溶液按照标准正文项下方法进行试验，考察下列不同温湿度组合条件对薄层色谱行为的影响：①常温常湿T：25℃RH：54%；②高温高湿T：40℃RH：75%；③低温低湿T：4℃RH：18%；④常温高湿T：25℃RH：75%；⑤常温低湿T：25℃RH：18%。

结果：按照上述不同温湿度条件下进行试验，温度在4～40℃、相对湿度在18%～75%范围内，供试品色谱中目标斑点分离效果均较好，无明显变化。详见图1、7、8、9、10。

图7 温湿度条件考察（高温高湿）TLC图谱图

图8 温湿度条件考察（低温低湿）TLC图谱

图9 温湿度条件考察（常温高湿）TLC图谱图

图10 温湿度条件考察（常温低湿）TLC图谱

2.6 重复性实验

取10批供试品，按照标准正文项下方法进行试验。结果：10批供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的荧光斑点，详见图11。

图11 防风鉴别重复性考察TLC图谱

3 讨论

以5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素苷及防风对照药材为对照，共筛选了5种供试品溶液制备方法、多种展开条件，通过专属性、耐用性及10批样品重复性实验。结果表明，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，均显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰。说明本方法具有较好的专属性、耐用性及重复性，可作为消风止痒颗粒中防风的薄层鉴别方法。