炒甘草炮制工艺及质量标准研究

孟珈同，邱智东，李军鸽，王永春，唐秋竹

（长春中医药大学创新实践中心·吉林长春·130117）

甘草是药食同源药材，具有调和药性、清热解毒、润肺止痛的功效，并有“十方九草”的美誉[1]。古代甘草的炮制方法诸多，有炙、炒、炮、爁、焙、水炙、煨、蜜制、酒制、麸制、酥制、浆水制、胆汁制、醋制等[2]。但现2020版《中国药典》收载的仅为甘草饮片、炙甘草两种。炒甘草只收载于2005年版《河南省中药饮片炮制规范》、2008年版《上海市中药饮片炮制规范》、2015年版《浙江省中药饮片炮制规范》、2015年版《浙江省中药饮片炮制规范》的地方标准中，且具体工艺参数不明确。而清炒甘草具有补中益气，养正和中，调补胃气，调和诸药的作用，广泛应用于不同疗效的古代名方中[3]。本研通过L9(34)正交实验优化清炒甘草的炮制工艺，参照2020年版《中国药典》甘草项下相关方法，建立炒甘草的炮制工艺及质量标准，为炒甘草的质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高速裁断往复式切药机（富阳康华制药机械有限公司）；高精度超薄电子厨房秤（广州市拓普电子科技有限公司）；小型炒药机（MS-5型炒货机）；中型炒药机（H-系列性多功能电热炒货机）；高校液相色谱仪（岛津2030）；盛药盘；毛巾。

1.2 材料

甘草苷（中国食品药品检定研究院 批号：111610-201908）；甘草酸铵（中国食品药品检定研究院批号：110731-202021）；甘草（甘草）对照药材（中国食品药品检定研究院批号：120904-202021）；甘草药材（产地：新疆墨玉县224团。批号XME-20200919），经长春中医药大学药学院翁丽丽教授鉴定为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisc.的干燥根和根茎，按照2020年版《中国药典》一部甘草项下检验，各项均符合规定。乙腈、甲醇均为色谱纯；水为自制超纯水。

2 实验方法

2.1 切制

2.1.1 软化

取XME-20200919批甘草，除去杂质，抢水洗。将净制后的甘草于室温50℃、70℃、80℃下软化至弯而不折即可。软化时以湿布遮盖，适当喷洒清水，使药材始终保持湿润。软化后切4mm厚片，自然晾干。以药材软化时间、甘草苷与甘草酸含量、败片率为指标考察软化温度。

2.1.2 干燥

取软化后XME-20200919批甘草药材，切4mm厚片，分别于室温40°C、60°C、80°C下干燥，以甘草苷及甘草酸含量、水分、干燥时间为指标考察干燥温度。

2.2 炒制

2.2.1 正交实验设计

以炒制温度、炒制时间和炒锅转数为考察因素。通过单因素实验，确定各因素水平，以炒甘草的性状、甘草苷含量和甘草酸含量作为评价指标对炒甘草的炮制工艺进行优选，因素水平见表1。选取XME-20200919批干燥后的甘草饮片9份，每份500g，按照正交实验设计方案炒制甘草饮片，得到最佳工艺，L9（34）正交试验方案见表2。

表1 因素水平表

表2 L9(34)正交实验方案

2.3 炮制工艺验证实验

分别取甘草药材3份，每份500g，按照上述最佳炮制工艺验证。

3 实验结果

3.1 软化温度结果

室温软化时间长，药材易发霉，且药材硬芯较多，不利于切制。热润法时间短，败片率低，且加热对甘草含量影响不大，因此选择热润法软化甘草。结合节约能源等方面考虑，选择70℃热润软化甘草，结果见表3。

表3 软化温度实验结果

3.2 干燥温度结果

干燥温度对甘草饮片性状及甘草苷、甘草酸含量影响不大。结合实际生产情况和经济成本，可选择自然晾干。

表4 干燥温度实验结果

3.3 正交实验结果

炒甘草性状以甘草饮片表皮颜色呈深褐色，切面颜色深黄色且颜色均匀，部分饮片微具焦斑，具焦香气为标准对性状打分。炒甘草性状为判断样品是否符合要求的首要条件，在性状合格的基础上，通过甘草苷和甘草酸的含量测定结果进一步确定清炒条件。因此，性状、甘草苷含量和甘草酸含量的权重系数分配为0.50、0.25、0.25。按公式（1）计算综合评分（Y）[4]。式中Y1为性状得分结果，Y2为甘草苷含量测定结果，Y3为甘草酸含量测定结果，Ymax为各项结果中最大值。正交实验结果见表5-6。

表5 正交试验结果

表6 正交实验方差分析

由表5-6可知，各因素影响程度依次为炒制温度＞炒锅转数＞炒制时间。其中炒制温度对实验结果的影响有统计学意义（P＜0.05），而炒制时间、炒锅转数对实验结果的影响无统计学意义（P＞0.05）。炒制温度（A）：A2＞A3＞A1，炒制时间（B）：B2＞B1＞B3，为保证炒制时的均匀性，选择炒锅转数（C）为C3即可，因此确定最佳工艺为A2B2C3，即150℃清炒25 min，炒锅转数为20 rpm/min。

3.4 验证实验结果

结果见表7。

表7 验证实验结果

4 炒甘草质量标准

4.1 性状

本品呈类圆形或椭圆形的厚片。外表皮深红棕色或深褐色，具纵皱纹。切面显深黄色，微具焦斑，略显纤维性，有明显放射状纹理及形成层环。质坚实，具粉性。气微，味甜而特殊。

4.2 薄层色谱

参照2020版《中国药典》一部甘草薄层鉴别方法对批号为XME-20200919的炒甘草样品进行薄层鉴别。在供试品色谱中，斑点清晰，分离度好，在与对照药材色谱与对照品色谱中相应位置显相同颜色的荧光斑点，详见图1。

图1 炒甘草薄层鉴别色谱图

4.3 水分与总灰分

取10批炒甘草供试品，照《中国药典》2020年版四部通则2302与通则0832第二法烘干法测定。平均水分为3.3%，炒甘草饮片水分不得过5.0%。平均总灰分为3.7%，炒甘草饮片总灰分不得过5.0%。结果见表8。

表8 炒甘草水分、总灰分测定结果

4.4 甘草苷和甘草酸含量测定

4.4.1 色谱条件

色谱柱Venusil MP C18（4.6×250mm，5μm）；以乙腈为流动相A，0.05%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～8 min，A：19%；8～35 min，A：19%～50%；35～36min，A：50%～70%；36～40 min，A：70%）；流速：1.0 mL/min；波长：237 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。

4.4.2 对照品溶液的制备

参考2020年版《中国药典》一部甘草【含量测定】的对照品溶液制备方法。

4.4.3 供试品溶液的制备

参考2020年版《中国药典》一部甘草【含量测定】的供试品溶液制备方法。对照品和炒甘草液相图见图2。

图2 炒甘草及对照品高效液相色谱图

4.4.4 线性关系考察

分别配浓度为0.02mg/ml、0.06mg/ml、0.10mg/ml、0.14mg/ml、0.2mg/ml的甘草苷对照品溶液，及浓度为0.10mg/ml、0.30mg/ml、0.50mg/ml、0.70mg/ml、1.0mg/ml

甘草酸对照品溶液。精密吸取上述不同浓度对照品溶液10μL，注入液相色谱仪。以对照品峰面积为纵坐标（Y），对照品溶液质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，计算回归方程。甘草苷：Y=1950735X-2830.4，r=0.9999，在0.02～0.24μg内线性关系良好；甘草酸铵：Y=423098X-1124.2，r=0.9999，在0.12～1.17μg内线性关系良好。

4.4.5 精密度试验

取供试品溶液，按4.4.1项下方法连续进样6次，测得甘草苷和甘草酸含量的RSD分别为0.4%和0.3%，表明仪器精密度良好。

4.4.6 重复性试验

按4.4.3项下方法制备同一批次6份供试品溶液，按4.4.1项下方法测定，测得甘草苷和甘草酸含量的RSD分别为2.49%和2.95%，RSD＜3%，表明此方法重复性良好。

4.4.7 稳定性试验

取炒甘草供试品溶液，分别在0h、8h、12h、18h、24h按4.4.1项下方法测定甘草苷及甘草酸含量。测得甘草苷和甘草酸含量的RSD分别为0.6%和0.3%，表明该方法在24小时内基本稳定。

4.4.8 加样回收率试验

取同一供试品（批号XME-20200919含量：甘草苷：7.4351mg/g甘草酸：30.9011mg/g）6份，每份约0.1g，精密称定，分别精密加入以70%乙醇制备对照品溶液100ml，对照品浓度为甘草苷0.0083mg/ml，甘草酸0.0340mg/ml，按照4.4.3方法制备，计算加样回收率，结果见表9。表明本方法准确度符合要求。

表9 加样回收率结果

4.4.9 甘草苷和甘草酸含量

称取10批甘炒甘草样品，每批精密称定2 g，按4.4.3方法制备供试品溶液，按4.4.1方法测定甘草苷与甘草酸含量。10批样品甘草苷平均转移率为102.53%，2020年版《中国药典》中甘草药材中甘草酸含量限度规定不得低于0.50%，按90%转移率计算，甘草苷（C21H22O9）不得少于0.45%；甘草酸平均转移率为99.08%，2020年版《中国药典》中甘草药材中甘草酸含量限度规定不得低于2.0%，按90%转移率计算，甘草酸（C42H62O16）不得少于1.8%。结果见表10。

表10 10批药材甘草苷含量测定结果及炒甘草饮片转移率

5 结果与讨论

生品甘草性平、味甘，具有和中缓急、调和诸药的功效，在临床中应用广泛[5]。而炒甘草则是将甘草轻微炭化，从而增加了止血、降糖、抗溃疡、保肝、抗炎等功效[6]。张仲景所著古代医学著作《伤寒杂病论》中应用炙甘草的药方多达68个，此炙甘草即为今炒甘草[7]，可见其应用的广泛性。本研究建立了甘草饮片切制工艺及最佳炒甘草炮制工艺：取甘草药材，除去杂质，抢水洗净。将甘草药材置适宜容器内，以湿布遮盖，70℃加热闷润，润透即止，切4mm厚片，自然晾干。将晾干后的饮片于炒药机中150℃炒制25min，炒锅转数为20 rpm/min。炒甘草的质量标准为：饮片表皮呈深褐色，切面颜色深黄色且颜色均匀，部分饮片微具焦斑，具焦香气。水分不得过5.0%，总灰分不得过5.0%，甘草苷（C21H22O9）含量不得少于0.45%，甘草酸（C42H62O16）含量不得少于1.8%。综上，本研究制订的炒甘草最佳炮制工艺科学合理、稳定可行，可为炒甘草的生产、质量控制及古代名方制剂开发提供参考。