不同产地金银花中酚酸类含量的测定

张浩，叶静，马长宏，王海艳，丛鑫，王屾

（辽宁盘锦检验检测中心·辽宁盘锦·124010）

金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花[1]。其性味甘，寒，气清香，归心、肺、胃经，清热而不伤胃，芳香透达亦能祛邪[2]。素有“中药中的青霉素”之称[3]，是清热解毒的良药。金银花中的化学成分主要是有机酸类、黄酮类、三萜皂苷类、挥发油类、环烯醚萜类等[4-5]。金银花广泛应用于临床，主要治疗风热感冒、温病发热、痈肿疔毒等，具解热、抑菌、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、保肝利胆、增强免疫力等功效[6-7]。尤其是在抗击新型冠状病毒疫情期间，其市场需求量十分巨大。现有文献报道关于金银花的质量评价中，使用高效液相色谱法对金银花单一成分（如绿原酸、咖啡酸、总黄酮、木犀草苷等）的含量测定和指纹图谱的研究较多[8-11]。《中国药典》2020年版规定，酚酸类含量为金银花主要质量控制指标之一，酚酸类中绿原酸具抗菌、抗抑郁、抗氧化、保肝等生物活性[12]。因此，本研究为扩大金银花药用资源为出发点，对辽宁盘锦地区栽培种植的金银花酚酸类的含量进行测定，并根据《中国药典》2020年版金银花项下的内容及方法，同内蒙古、甘肃、山东、河北、河南、吉林等常用6个产区的金银花中绿原酸、3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸进行含量测定并进行对比，期望能够为7个产区金银花的质量评价提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪（日本岛津公司，SPD-20A UVVIS检测器）；PRO-DI-T超纯水机（德国Sartorius公司）；BP211D电子天平（德国Sartorius公司）；KQ3200DB型超声波清洗器（江西赣仪科技有限公司）；0.45μm滤膜（天津津腾实验设备有限公司）。

1.2 试剂与试药

绿原酸对照品（纯度为96.3%，批号：110753-202119）、3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸对照品（纯度为94.3%，批号：111782-201807）、4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸对照品（纯度为95.1%，批号：111894-202104）均购自中检院；乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；磷酸为色谱纯。

1.3 样品

金银花样品分别采收于内蒙古、甘肃、山东、河北、河南、吉林、辽宁盘锦等7个地区，经辽宁盘锦检验检测中心主任中药师张国友鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序见表1；柱温为25℃；流速为0.7 mL·min-1；检测波长为327 nm；对照品溶液和供试品溶液的进样量均为2 μL；理论板数按绿原酸峰计算应不低于10000。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备

取绿原酸、3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸对照品，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇（75%）制成每1ml含0.28mg、0.15mg、44μg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品，粉碎（过四号筛），约0.5 g，称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇（75%）50 mL，称定，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30分钟，放冷，再称定，用甲醇（75%）补足，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验

取“2.2”项下对照品溶液和供试品溶液适量，按照“2.1”项色谱条件下进行测定，记录色谱图，见图1。绿原酸对照品色谱图中绿原酸保留时间为8.6 min，理论板数大于10000，3,5-二-O-咖啡酰奎宁酸保留时间为24.0 min和4,5-二-O-咖啡酰奎宁酸保留时间为27.3 min。

2.3.2 线性关系考察

分别精密称取一定量的绿原酸、3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸对照品于25 mL量瓶中，用甲醇（75%）定容至刻度，摇匀，配制成混合对照品母液。该母液中各对照品的浓度分别为绿原酸0.420 mg·mL-1、3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸0.225 mg·mL-1和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸66 μg·mL-1。取上述混合对照品母液加甲醇（75%）进行梯度稀释，获得6个浓度梯度的溶液，然后按“2.1”项色谱条件进样，以色谱峰面积为纵坐标（Y），对照品溶液的浓度为横坐标（X），绘标准曲线，得出回归方程，如表1所示，表明线性关系良好。详见表2。

表2 线性回归方程及相关系数

2.3.3 精密度试验

取质量浓度为0.205 mg·mL-1绿原酸、0.110 mg·mL-13，5-二-O-咖啡酰奎宁酸和34.036 μg·mL-14，5-二-O-咖啡酰奎宁酸溶液，按“2.1”项色谱条件下，连续进样6次，得出峰面积。计算得出其RSD分别为1.12%、1.06%和1.23%。表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验

取样品约0.5 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.1”项色谱条件下测定，计算得出绿原酸、3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸的RSD分别为1.23%、1.21%和1.29%。表明该方法的重复性良好。

2.3.5 稳定性试验

取样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件下，分别于0、4、8、12h进行测定，计算得出绿原酸、3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸的RSD分别为1.12%、1.02%和1.27%，表明供试品溶液在12 h内的稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验

取吉林金银花样品0.25 g，共18份，分两大组，两大组分三个小组加绿原酸、3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸对照品（相当于样品浓度的80%、100%、120%）。按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，另取“2.2.1”项下绿原酸、3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸对照品溶液进样测定比照，按“2.1”项色谱条件下进样，并计算出绿原酸、3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸低、中、高3个浓度的加样回收率。结果表明，绿原酸加样回收率为99.0%～101.2%，平均回收率99.8%，RSD为1.02%；3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸加样回收率为98.8%～101.5%，平均回收率100.6%，RSD为1.07%和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸加样回收率为99.2%～101.6%，平均回收率100.1%，RSD为1.09%。

2.4 样品含有量测定

取7个产区的样品，粉碎（过四号筛），精密称取0.5 g，内蒙古、甘肃、山东、河北、河南、吉林等6个产区各3份；辽宁盘锦产区取3批样品，每批3份，共9份。按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，另取“2.2.1”项下绿原酸、3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸对照品溶液，按“2.1”项色谱条件下进样，测得7个不同产区金银花样品中绿原酸含量大于1.5%；含酚酸类以绿原酸、3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸的总量计，均大于3.8%，结果符合《中国药典》2020年版的规定。详见表3。

表3 不同产区样品中绿原酸、3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸含有量测定结果（%，n=3）

3 讨论

《中国药典》2020年版一部项下规定金银花中含绿原酸不得少于1.5%，含酚酸类以绿原酸、3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸的总量计，不得少于3.8%[1]。结果表明，7个产区的金银花样品均符合《中国药典》标准的要求，其中河南的含量最高。

金银花是医学临床上常用的中药之一，有着“中药中的青霉素”的美誉，作为夏季茶饮的材料之一，也受到了我国北方许多地区百姓的欢迎，由于其种类比较多，质量间存在一定的不同，再加上生长区域、采集时间、加工炮制方法等对其成分的组成及含量均产生不同程度的影响。因此，建立科学合理的质量评价体系对于金银花的质量控制十分重要。整体分析，《中国药典》2020年版一部中对金银花酚酸类中绿原酸的含量限度比较低，建议提高药典标准。