一年蓬中焦袂康酸对临床致病关键酶的抑制作用研究

丁俊楠，钱鹏旭，迟东泽，郭鑫*，臧皓*

(1.通化师范学院医药学院，通化 134002；2.吉林省药品审核查验中心，长春 130062)

一年蓬又名牙肿消、治疟草等，为菊科飞蓬属植物[1]，原产北美洲，于19世纪末传入中国，其繁殖力强、分布广，在我国主要分布于吉林省、河北省、山东省、江苏省、安徽省、浙江省、江西省、福建省、四川及西藏等地，多生于路边旷野或山坡荒地[2]。该植物为一年或两年生草本，茎粗壮，高度约为0.3～1米，直立生长，其上部具有分枝，基部叶于花期时枯萎；上部多为长圆形或宽卵型，少数为近圆形，下部叶与基部叶具有相同形状，但叶柄较短，中部和上部的叶较小，为长圆状披针形或披针形；头状花序一般具有数个或多个，排列成疏圆锥花序样，花期为6月到9月[3]。该植物中主要含有黄酮类、萜类、有机酸等成分[4]，具有改善微循环、降低血液粘度、解热、镇痛、抗炎等多方面的药理作用[5-6]，常被民间医学用于治疗疟疾、消化不良，肠炎，流行性肝炎，淋巴结炎，急性炎症和肥胖等疾病。但其作用机制尚不明确。

脲酶[7]也称尿素溶液酶，归属于氟苯酶类-尿素溶液酰胺基水解酶。其具有很高的特异性，它能够催化反应氟苯类化合物、尿素溶液造成二氧化碳和氨。氨会加快肠黏膜细胞的脆化，进而影响肠胃对营养元素的消化吸收。酪氨酸酶[8]又称多酚氧化酶等，是一种结构复杂的含多亚基的含铜氧化还原酶，广泛存在于微生物、动植物和人体中，具有着广泛的用途，在生物体内具有多种重要的生理功能，特别在皮肤美白、抗氧化作用等方面表现尤为突出。黄嘌呤氧化酶[9]是一种黄素蛋白酶，存在于各种生物体中，可催化体内的嘌呤底物形成尿酸。对于痛风等疾病的患者来说，黄嘌呤氧化酶抑制剂无疑是他们选择用药的方式之一，因此对于黄嘌呤氧化酶抑制剂的进一步的挖掘也是十分必要的。

本实验以一年蓬中焦袂康酸为研究对象，对其进行脲酶抑制实验、酪氨酸酶抑制实验以及黄嘌呤氧化酶抑制实验研究，旨在为一年蓬的进一步开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

焦袂康酸，实验室自制；无水磷酸二氢钾（99.5%）、无水磷酸氢二钾（99%）、无水磷酸氢二钠（99%）、无水磷酸二氢钠（99%）萨恩化学；次氯酸钠、硫脲、苯酚、硝普钠、尿素 西亚化学；脲酶、黄嘌呤氧化酶、酪氨酸酶、别嘌醇、熊果苷，美国sigma公司；NaOH、HCl、乙醇等常规化学试剂 均为国产分析纯。

VDHG-9245A型恒温箱，上海一恒科技有限公司；TDL-5-A型号低速大容量离心机，上海安亭科学仪器；HWS12型电热恒温水浴锅，上海-恒科技有限公司；电热鼓风干燥箱，上海-恒科学仪器有限公司；HY-2旋涡混匀仪，上海仪电科学仪器股份有限公司；BSA224S-CW型电子天平，赛多利斯科学仪器；ReadMax1900Plus型光吸收酶标仪，上海闪普生物科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脲酶抑制实验

参照[10]的方法，略有改动。焦袂康酸样品及阳性参比样品硫脲的溶液配制均采用PBS。配制100 mM/L的尿素溶液、5 U/mL的脲酶溶液、1%苯酚溶液、0.5%氢氧化钠溶液备用。在96孔板中加入40 μL尿素溶液、10 μL脲酶溶液以及10 μL样品溶液后混匀，于37℃孵化30 min，再加40 μL苯酚溶液溶液和40 μL氢氧化钠溶液，混匀，再于37℃孵化30 min。测定其在625 nm处的吸光度值记为As，进行3次平行实验；在96孔板中加入40 μL尿素溶液、10 μLPBS溶液以及10 μL样品溶液后混匀，于37℃孵化30 min，再加40 μL苯酚溶液溶液和40 μL氢氧化钠溶液，混匀，再于37℃孵化30 min。测定其在625 nm处的吸光度值记为Ac，进行3次平行实验；在96孔板中加入40 μL尿素溶液、10 μL脲酶溶液以及10 μL PBS溶液后混匀，于37℃孵化30 min，再加40 μL苯酚溶液溶液和40 μL氢氧化钠溶液，混匀，再于37℃孵化30 min。测定其在625 nm处的吸光度值记为Ab，进行3次平行实验；按下列公式计算抑制率。

1.2.2 酪氨酸酶抑制实验

参照[11]的方法，略有改动。焦袂康酸样品及阳性参比样品熊果苷的溶液配制均采用PBS。配制0.1 M的PBS、200U/mL酪氨酸酶溶液和5mM L-酪氨酸溶液。在96孔板中加入100 μL L-酪氨酸溶液、20 μL 0.1M PBS和40 μL样品以及40 μL酪氨酸酶溶液于37℃孵化20 min后，在450 nm处测定OD值记为As，进行3次平行实验；在96孔板中加入100 μL L-酪氨酸溶液、20 μL 0.1M PBS和40 μL样品以及40 μLPBS溶液于37℃孵化20 min后，在450 nm处测定OD值记为Ac，进行3次平行实验；在96孔板中加入100 μL L-酪氨酸溶液、20 μL 0.1M PBS和40 μL PBS溶液以及40 μL酪氨酸酶溶液于37℃孵化20 min后，在450 nm处测定OD值记为Ab，进行3次平行实验；

1.2.3 黄嘌呤氧化酶抑制实验

参照[12]的方法，略有改动。焦袂康酸样品及阳性参比样品别嘌醇的溶液配制均采用PBS。配制0.07 M的PBS、0.01 U/mL黄嘌呤氧化酶、150 μM黄嘌呤溶液和1N HCl溶液。在96孔板中加入30 μL黄嘌呤氧化酶溶液、35 μL PBS和50 μL样品于25℃孵化15 min后，在加入60 μL黄嘌呤溶液，于25℃孵化30 min，加入25 μL 1N HCl终止反应，混匀后立刻在290 nm下测OD值记为As进行3次平行实验；在96孔板中加入30 μLPBS溶液、35 μL PBS和50 μL样品于25℃孵化15 min后，在加入60 μL黄嘌呤溶液，于25℃孵化30 min，加入25 μL 1N HCl终止反应，混匀后立刻在290 nm下测OD值记为Ac进行3次平行实验；在96孔板中加入30 μL黄嘌呤氧化酶溶液、35 μL PBS和50 μL PBS溶液于25℃孵化15 min后，在加入60 μL黄嘌呤溶液，于25℃孵化30 min，加入25 μL 1N HCl终止反应，混匀后立刻在290 nm下测OD值记为Ab进行3次平行实验；按下列公式计算抑制率。

1.3 数据处理

利用SPSS 17.0软件处理数据来进行差异性显著分析，其中P＜0.05差异显著；Office excel 2003软件进行数据处理及绘图，每次试验设计3个平行，结果用平均值±标准差来表示。

2 结果与分析

2.1 抑制脲酶的能力

一年蓬中焦袂康酸对试验体系中的脲酶有显著的抑制作用（P＜0.05），如图1所示，硫脲溶液对脲酶的抑制效果非常显著，与硫脲相比，当一年蓬中焦袂康酸质量浓度小于200 μg/mL时，清除率变化不显著；当浓度大于200 μg/mL时，随着一年蓬中焦袂康酸浓度增加，对脲酶的抑制效果显著增强；在500 μg/mL时达最大清除率64.78%。

图1 脲酶抑制活性

2.2 抑制酪氨酸酶的能力

一年蓬中焦袂康酸对试验体系中的酪氨酸酶有显著的抑制作用（P＜0.05），如图2所示，熊果苷溶液对酪氨酸酶的抑制效果非常显著，与熊果苷相比，当一年蓬中焦袂康酸质量浓度小于600 μg/mL时，清除率随着浓度的不断生高而显著升高；当浓度大于600 μg/mL时，随着一年蓬中焦袂康酸浓度增加，对酪氨酸酶的抑制效果变化不显著；在750 mg/mL时达最大清除率68.85%。

图2 酪氨酸酶抑制活性

2.3 抑制黄嘌呤氧化酶的能力

一年蓬中焦袂康酸对试验体系中的黄嘌呤氧化酶有显著的抑制作用（P＜0.05），如图3所示，别嘌醇溶液对黄嘌呤氧化酶的抑制效果非常显著，与别嘌醇相比，当一年蓬中焦袂康酸质量浓度小于300 μg/mL时，清除率变化并不显著；当浓度大于300 μg/mL时，随着一年蓬中焦袂康酸浓度增加，对黄嘌呤氧化酶的抑制效果变化显著；在750 μg/mL时达最大清除率77.86%。

图3 黄嘌呤氧化酶抑制活性

3 结论与讨论

一年蓬中焦袂康酸的脲酶抑制率、酪氨酸酶抑制率以及黄嘌呤氧化酶抑制率在一定范围内均随作用浓度的增大而活性增强，表现出较好的酶抑制活性。本实验中仅以一年蓬中焦袂康酸作为研究对象，进行了体外酶活性抑制的研究，并未研究其内在的药理功效，可进一步进行相关物质的深入的药理学试验研究，进一步探索一年蓬中焦袂康酸的药理活性及功效，为今后一年蓬的开发与利用提供理论基础。