黄芪-甘草配伍对大鼠肝CYP450酶不同亚型的影响

贾旭爽，陈宇杨，鲍慧玮，张亚杰

(长春中医药大学·吉林 长春·130117)

黄芪-甘草药对始载于《太平惠民和剂局方·卷五治诸虚》，由黄芪-甘草两味药组成[1]。黄芪和甘草相须为用，可以作为黄芪甘草汤单独应用，也可以应用于复方之中，用于治疗消化系统疾病、糖尿病等。本课题以甘草、黄芪为研究对象，采用Cocktail探针法，以探针药物的代谢消除百分率为指指标，考查甘草、黄芪药对及单药对对5种肝药酶（CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP2C9）活性的影响，以此为甘草、黄芪药对的临床合理联合用药提供实验依据。

1 实验材料

1.1 药品与试剂

甘草与黄芪两种饮片均购自吉林省宏检大药房有限公司；茶碱原料药（批号20190417)、双氯芬酸钠原料药（批号F20180226)、奥美拉唑原料药（批号J1805A，)、右美沙芬原料药（批号F180606),氯唑沙宗原料药（批号20190120)、普萘洛尔原料药（批号J1115A)、还原型辅酶II均购自上海源叶生物有限公司，原料药纯度大于等于98%；BCA蛋白试剂盒(批号:03415，上海天根生化科技)。

1.2 仪器设备

台式低温高速离心机(上海飞鸽仪器厂);LC-l0A型高效液相色谱仪、UV检测器、N-2000工作站(日本岛津公司);酶标仪(伯乐生命医学产品(上海)有限公司)。

1.3 实验动物

由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供雄性Wistar大鼠，180～220g。实验动物合格证号SCXK(吉)2020-0002。大鼠喂饲标准饲料和水，饲养于长春中医药大学动物中心、12h日夜节律。

2 方法

2.1 药物的制备与配制

2.1.1 供试品的制备

按《医林改错》中载黄芪和甘草的规定的剂量黄芪10g、甘草2.5g进行换算，取甘草、黄芪，浸泡1小时，8倍水文火煎煮30min，过滤后滤渣6倍水再煎煮30min，两次滤液经70℃浓缩，最终得黄芪-甘草组浓度为0.14g/mL生药。甘草、黄芪单煎液的浓度为0.14g/mL生药、0.028g/mL生药。

2.1.2 探针底物及内标溶液的配制

称取适量茶碱、双氯芬酸钠、奥美拉唑、右美沙芬和氯唑沙宗5中探针底物，加入甲醇溶液中摇匀备用,最终溶液中含有茶碱(10μmol/L)、双氯芬酸钠（25μmol/L）、奥美拉唑（25μmol/L）、右美沙芬（5μmol/L）、氯唑沙宗(50 μmol/L)[2]。

称取适量内标物普萘洛尔加入甲醇∶乙腈（1∶1）的混合溶液中，终浓度为100 μg/mL。

2.2 肝微粒体制备

2.2.1 取肝组织

处死后的大鼠在冰浴的托盘中剖开腹部，暴露肝脏，结扎肝门静脉，同时剪断下腔静脉，中肝动脉插硅胶管并灌注冰生理盐水进行冲洗，去除肝脏中残留的血液，反复冲洗到肝脏表面呈土黄色。

2.2.2 制备线粒体上清液

在冰浴的环境下，取一块土黄色的肝脏，用剪刀剪碎，加入4倍肝重的0.25 mol/L的冰蔗糖溶液，倒入玻璃匀浆管中，手动研磨至匀浆状，使微粒体均匀分散。研磨后的组织匀浆液放入冷冻离心机，9000 g离心15 min，用移液器取上清液备用，丢弃下层组织;将上清液再放入冷冻离心机，12500 g离心20 min，再用移液器取上清液备用，丢弃下层组织，所得上清液即为去线粒体上清液。

2.2.3 制备肝微粒体混悬液

88 mmol/L的CaCL2溶液0.1 mL中需加入1 mL上清液，按这个比例在上清液中加入CaCL2溶液(CaCL2的终浓度为8 mmol/L),充分混合，放在冰浴的环境中5 min，在冰浴适当进行振摇，最后放入冷冻离心机，27 000 g离心15 min，轻轻取出上清液，离心管中的沉淀就是肝微粒体。

2.3 肝微粒体蛋白含量测定

按试剂盒的说明完成样本蛋白含量测定。

2.4 肝微粒体孵育

用移液器在EP管中加入5种探针的混合液20μL，自然挥干后，EP管中加入肝微粒体，37℃恒温水浴，预孵育5min后，用移液枪加入NADPH启动生物转化反应。EP管中孵育体系总体积为200μL，其中肝微粒体总蛋白浓度为0.5mg/mL、NADPH终浓度为1mmol/L,CYP特异性探针药物的终浓度依次为茶碱(10μmol/L)、双氯芬酸钠（25μmol/L）、奥美拉唑（25μmol/L）、右美沙芬（5μmol/L）、氯唑沙宗(50 μmol/L)，体积不足用K2HP04/KH2P04缓冲液(0.05mol/L,pH=7.4)补充。

孵育反应30min时移液枪注入冰冷的甲醇∶乙腈（1∶1）的混合溶液200 μL，其中含有内标盐酸普奈洛尔(100 μg/mL)，终止肝药酶对底物的代谢作用，孵育溶液涡旋混匀后，13000g,4℃冷冻离心机离心10 min，取上清液冷藏备用。按照预先测定的HPLC条件，取上清液测反应后各探针药物的剩余量，并按下式计算各探针底物的代谢消除百分率。

2.5 色谱条件

2.5.1 5种探针底物的HPLC条件

色谱柱Agilent TC-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～8 min，10% A；8～10 min，10%→25% A；10～24 min，25%A；24～34 min，25%→70% A；34～37 min，70%→100%A；37～40 min，100% A）[3]；流速1.0 mL/min；柱温35℃；检测波长210 nm。结果显示5种探针药物与内标物峰形良好，分离完全，无杂质峰干扰，内标物质对其他待测峰无干扰，专属性强[4]，结果见图1。

图1: 大鼠肝微粒体中5种探针药物及其代谢产物的的HPLC色谱图（A:5种混合探针底物及内标物对照品溶液；B:5种混合探针底物对照品溶液；1.茶碱；2.奥美拉唑；3.普萘洛尔；4.右美沙芬；5.氯唑沙宗；6.双氯芬酸钠）

2.5.2 线性关系考察

精密量取各浓度的探针底物溶液于EP管中，氮吹，每个浓度设3份，建立工作曲线[5]。实验结果以各探针底物和内标物的峰面积比值（y）对各探针底物的浓度（x）进行线性回归，得回归方程[6]。

2.5.3 精密度与准确度

选择相同浓度，用空白组大鼠肝药酶配制质量控制样品，制备6份样品[5]，按照样品处理方法处理分析，分别计算各探针底物的精密度和准确度。

2.6 数据处理及统计分析

3 结果

3.1 甘草-黄芪及单药体内诱导对大鼠肝微粒体CYP450酶活性的影响

各给药组对茶碱、奥美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗、双氯芬酸钠5种探针底物的代谢消除百分率测定，结果见表1。

与空白对照组比，甘草、甘草-黄芪可使茶碱代谢百分率增加(P＜0.0 5），甘草、甘草-黄芪对CYP1A2酶活性具有诱导作用；甘草-黄芪组可使氯唑沙宗代谢百分率增加(P＜0.0 5），对肝微粒体CYP2E1酶活性具有诱导作用；甘草、甘草-黄芪可使双氯芬酸钠代谢百分率具有显著降低(P＜0.01），因此对甘草、黄芪、甘草-黄芪对CYP2C9酶活性具有抑制作用。

表1 甘草-黄芪及单药对5种底物的消除百分率（%）（±s，n=5）Table 1 Licorice,astragalus membranaceus and single medicine eliminating percentage of 5 kinds of substrates（%）(±s、n=5)

表1 甘草-黄芪及单药对5种底物的消除百分率（%）（±s，n=5）Table 1 Licorice,astragalus membranaceus and single medicine eliminating percentage of 5 kinds of substrates（%）(±s、n=5)

注：与空白对照组比*P＜0.05,**P＜0.01

组别 茶碱 奥美拉唑 右美沙芬 氯唑沙宗 双氯芬酸钠空白对照组 16.46±1.56 8.33±1.10 51.80±7.25 27.01±1.69 18.09±1.39甘草组 19.27±0.86* 9.15±1.95 53.99±10.07 29.00±6.35 6.61±1.16**黄芪组 17.53±1.69 10.7±1.21 49.21±3.48 28.77±9.83 8.13±1.83**甘草-黄芪组 20.42±1.59* 8.11±0.74 45.61±7.24 30.27±8.65* 6.80±1.16**

4 讨论

药对指两味药的配伍使用，具有药味精简、结构固定、临床实用的特点，是方剂的基础结构，又是方与方之间的衔接。药对的运用在方剂中得以体现，药对又促成了方剂的化裁、革新[8]。甘草和黄芪药对是临床常用药对，既可以单独成方“黄芪甘草汤”，也可以和其他药物配成复方，不同药物配伍使用的过程中会发生相互作用，其中一种可能是对肝药酶产生诱导或抑制作用，从而使药物的疗效和损害作用产生影响，研究药物对肝药酶的影响可以为临床高效低毒用药提供参考。

本研究从对肝药酶活性的层面来阐述甘草、黄芪配伍对CYP450酶的影响。结果显示，甘草、黄芪、甘草-黄芪组对CYP2C19酶活性没有影响；甘草、黄芪、甘草-黄芪组对CYP2D6酶活性没影响；甘草、甘草-黄芪对对CYP1A2酶具有诱导作用；甘草-黄芪对CYP2E1酶具有诱导作用，甘草、黄芪、甘草-黄芪对CYP2C9酶具有抑制作用，因此，甘草-黄芪能诱导CYP1A2和CYP2E1酶，抑制CYP2C9酶。

CYP1A2约占肝脏总氧化酶含量的13%，在药物代谢、前致癌物代谢及活化的过程中起着重要的作用，并参与咖啡因、茶碱、丙咪嗪、三环类抗抑郁药、氯氮平、褪黑素、普萘洛尔、激素和类固醇等药物的代谢[9]，甘草、甘草-黄芪与这些药物合用要减少用药剂量；CYP2E1参与多种一前毒物和前致癌物等化合物的代谢，促其生成毒性代谢物，如乙醇、酮、卤族溶剂、二烷基亚硝胺等[10]，甘草-黄芪和这些物质合用时主要剂量和使用时间；CYP2C9参与甲苯磺丁脲、华法林、苯妥英钠、非甾体类抗炎药如喜康、罗芬等、吩噻嗪类、磺胺类抗菌药磺胺甲基异恶唑、镇静催眠药烯苯巴比妥、抗精神病药四氢大麻酚、抗肿瘤药环磷酰胺、性激素孕酮、睾丸酮等[10]，甘草、黄芪、甘草-黄芪与这些药物合用时注意观察不良反应。