东北牛防风果实精油生物活性研究

蔡馨瑶，潘红阳，于旺，胡馨殊，刘雪莲

（通化师范学院·吉林通化·134002）

植物精油属于植物体内的次生代谢物质，是一类可随水蒸气蒸馏，具有一定芳香气味并且能在常温下挥发的油状物质的总称。植物学上称为精油，商业上则称芳香油，而化学和医药学上称挥发油，许多研究表明植物精油具有抗氧化活性和抑菌活性，在日化、饲料等多个领域应用广泛[1-10]。植物精油作为天然抗氧化剂和抑菌剂，具有安全、高效等优点，具有巨大的开发潜力和广阔的应用前景。

东北牛防风（Heracleum moellendorffii）是伞形科多年生草本植物，又叫老山芹、土当归、山芹菜等，全株具有挥发油，生长于中高纬度河岸湿草地、草甸子、山坡林下及山地混杂林缘等阴湿环境，为药食同源植物[11-12]。东北牛防风富含氨基酸及膳食纤维，可帮助胃肠蠕动，还富含香豆素类、黄酮类化合物，具有降血脂、消炎等作用的皂苷，以及具有抗肿瘤、免疫调节等多种功效的多糖，对降血压血糖等有一定功效[13]，被称为山野菜中的“绿色黄金”。目前关于东北牛防风的研究主要集中在化学物质含量及生物活性[14-17]，营养物质含量及生理特征[18-19]，栽培[20-22]等方面，但关于东北牛防风果实精油生物活性研究未见报道。因此，本实验对东北牛防风果实精油进行提取并对其抗氧化活性、抑菌活性进行研究，旨在为东北牛防风精油的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

材料取自通化师范学院实验基地，待东北牛防风果实成熟，收集果实，除去杂质和腐坏果实，将优质果实收集晾干备用。实验用菌种（黑根霉、金黄色葡萄球菌）为通化师范学院实验室保存。

1.2 实验方法

1.2.1 东北牛防风果实精油的提取

1.2.2 抗氧化活性测定

1.2.2.1 DPPH清除率的测定

参考尹浩等[23]的测定方法并稍加修改。取DPPH·39.43 mg溶于1 000 mL溶剂无水乙醇中（0.1 mmol/L），充分振摇使其完全溶解。配制不同浓度梯度的东北牛防风果实精油无水乙醇溶液，浓度分别为2、4、6、8、10g/ml，以抗坏血酸作为阳性对照。分别0.1 mL东北牛防风果实精油溶液与3.9 mL上述DPPH·无水乙醇溶液混合，室温下避光反应30 min，测定混合液在516 nm的吸光值。以无水乙醇为空白样，平行测定3次，结果取平均值。DPPH自由基清除率按下式计算：

式中：A0为DPPH·溶液吸光值；At为待测样品与DPPH·反应t min后的吸光值。

1.2.2.2 羟自由基清除率的测定

采用水杨酸捕获法测定抗氧化性[15]。配制不同浓度梯度的东北牛防风果实精油无水乙醇溶液，浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1g/ml，以抗坏血酸作为阳性对照。取2mL不同浓度的样品稀释液，依次加入1mL10mmol/L的水杨酸-乙醇溶液和1mL10mmol/L的硫酸亚铁，最后加入30%过氧化氢，常温下水浴30min，用蒸馏水调零，于517nm波长下测吸光度（A1）。以蒸馏水代替样品稀释液作为空白组测吸光度（A0）；以蒸馏水代替过氧化氢作为对照组测定吸光度（A2）。进行3次平行实验，取平均值。清除率计算公式为：

“总裁对话”分两轮展开，在第一轮“制造新生态变革”对话环节，由MM《现代制造》杂志总编冯建平先生主持，参与对话嘉宾有：德马吉森精机中国总裁/首席运营官Dr.Frank Beermann先生、北京起重运输机械设计研究院有限公司党委书记兼副总经理孙吉泽先生和达索系统大中华区创新技术中心首席技术官赵文功先生、菲尼克斯（中国）投资有限公司副总裁彭晓伟先生和北京伍强科技有限公司董事长尹军琪先生。

1.2.3 抑菌活性测定

1.2.3.1 PDA培养基制备

将马铃薯去皮切成小块，称量200g浸泡在无菌水中。电磁炉加热煮沸20min，将混合物通过滤网,除去残渣得到滤液，加水至1000ml。继续加热滤液，沸腾后加入葡萄糖以及琼脂粉各20g，待琼脂粉溶解后，用NaOH调pH，将培养基倒入锥形瓶中，置于灭菌锅灭菌。

1.2.3.2 实验菌种的扩繁

培养皿中培养黑根霉，扩增后再次纯化备用。金黄色葡萄球菌则采用购买的专业菌种。

1.2.3.3 活化菌种

在超净工作台中，将金黄色葡萄球菌转接在培养基上划线，恒温培养箱37℃培养36h。

1.2.3.4 菌饼制备

黑根霉活化后转接于PDA培养基中，培养箱28℃培养24h，使用取饼器在黑根霉菌丝部位取材，制成菌饼。

1.2.3.5 菌悬液制备

将活化后的金黄色葡萄球菌转移至装有无菌水的试管中混匀制成菌悬液。

1.2.3.6 东北牛防风果实精油药敏纸片制备

采用滤纸片扩散法测定抑菌效力[24]，用二倍稀释法[25]配制不同浓度的东北牛防风果实精油。利用打孔器打出直径6mm的圆形滤纸片，并将滤纸片用灭菌锅灭菌。在超净工作台中分别浸泡在0%、10%、20%、40%、80%、100% 6个浓度梯度的东北牛防风果实精油中，浸泡1h后，制成精油药敏纸片，阴干备用。

1.2.3.7 东北牛防风果实精油抑菌活性研究

在超净工作台中将已经配置完毕的6种浓度梯度的精油（无水乙醇作为对照组、0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%）用移液枪分别吸取20 μL，均匀涂抹在培养基表面。待精油阴干后，将黑根霉菌饼置于培养基中央[26]，每组实验3次重复，分别标记后，密封袋密封，置于风箱中28℃下培养24h。

在相同的无菌环境下，将金黄色葡萄球菌菌悬液均匀涂布于培养皿中，将不同精油含量的药敏纸片（浓度梯度为0%、10%、20%、40%、80%、100%，其中0%为无水乙醇浸泡，作为对照组）以相等间隔在培养基表面排成一圈。每组实验3次重复，有序标记后，置于恒温培养箱37℃下培养24h[27]。

1.3 数据处理

本实验所获得的实验数据均用Excel软件和SPSS25.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 东北牛防风果实精油对DPPH的清除效果

由图1可知，不同浓度东北牛防风果实精油对DPPH清除率随浓度的升高呈逐渐上升的变化趋势，东北牛防风果实精油浓度为10g/ml时，DPPH清除率最高为2.77%，与精油浓度为8g/ml的清除率相比差异不显著，与其他3个时期相比差异显著（P＜0.05），与阳性对照VC的清除率相比有很大差异。

图1 不同浓度东北牛防风果实精油对DPPH清除率的动态变化

2.2 东北牛防风果实精油对羟自由基的清除效果

由图2可知，不同浓度东北牛防风果实精油对羟自由基清除率随浓度的提高呈逐渐上升的趋势变化，东北牛防风果实精油浓度为1g/ml时，羟自由基清除率最高为46.90%，与精油浓度为0.8g/ml的清除率相比差异不显著，与其他3个时期相比差异显著（P＜0.05），与阳性对照VC的清除率相比有较大差异。

图2 不同浓度东北牛防风果实精油对羟自由基清除率的动态变化

2.3 东北牛防风果实精油对黑根霉的抑菌效果

表1 不同浓度东北牛防风果实精油对黑根霉的抑制作用

东北牛防风果实精油对黑根霉的抑菌效果可以通过黑根霉的生长直径大小进行比较（图3），结果见表1，东北牛防风果实精油对黑根霉具有明显的抑菌效果。随着精油浓度的提高，菌饼直径逐渐下降，反应抑菌效果逐渐增强。精油浓度在0.1%～0.4%之间，菌饼直径变化差异不显著。当浓度达0.8%～1%时，菌饼直径显著减少，说明抑菌能力显著增强。精油浓度为1%时，菌饼直径最小为4.73cm，抑菌效果最高。

图3 东北牛防风果实精油对黑根霉的抑制效果

2.4 东北牛防风果实精油对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

东北牛防风果实精油对金黄色葡萄球菌的抑菌效果可以通过金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小进行比较（图4），结果见表2，东北牛防风果实精油对金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌效果。随着精油浓度的提高，抑菌圈直径逐渐上升，反应抑菌效果逐渐增强。精油浓度在40%～80%之间，抑菌圈直径变化差异不显著。当浓度到达80%～100%时，抑菌圈直径显著增大，说明抑菌能力显著增强。精油浓度为100%时，抑菌圈直径最大为0.92cm，抑菌效果最高。

表2 不同浓度东北牛防风果实精油对金黄色葡萄球菌的抑制作用

图4 东北牛防风果实精油对金黄色葡萄球菌的抑制作用

3 结论

东北牛防风果实精油对DPPH和羟自由基清除率随浓度的升高而增大。当东北牛防风果实精油浓度为10g/ml时，DPPH清除率最高为2.77%;当东北牛防风果实精油浓度为1g/ml时，羟自由基清除率最高为46.90%。东北牛防风果实精油对黑根霉、金黄色葡萄球菌均具有一定的抑菌效果,这与顾仁勇[28]、李娜[29]研究结果一致。精油浓度在0.8%～1%之间对真菌的抑制效果最好。精油浓度在80%～100%之间对细菌的抑制效果最好，抑菌效果与东北牛防风果实精油浓度成正比。东北牛防风果实精油具有良好的生物活性。其在日化、饲料、医药、化工和食品保藏等领域中的应用具有很好的参考价值。