慢性实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠模型不同阶段抗原提呈细胞免疫应答作用分析

曹羿堃，刘风英，华 冰，周翔鱼

·论 著·

慢性实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠模型不同阶段抗原提呈细胞免疫应答作用分析

曹羿堃，刘风英，华 冰，周翔鱼

目的 对MOG35-55肽段诱导的实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)小鼠不同时期病理变化特点进行观察分析，探讨在EAE的发生、发展和迁延过程中抗原提呈细胞(APC)所起的作用及其作用机制。方法 利用MOG35-55肽段作为免疫原诱导C57BL/6小鼠制作慢性非缓解型EAE模型，在不同时期观察实验动物神经功能变化，进行组织病理学检查，通过WB、 RT-PCR等方法检测部分免疫指标。结果 研究发现MOG35-55肽段可以成功诱导出慢性非缓解型EAE动物模型。与对照组比较，EAE组小鼠在发病过程中，脑组织出现以单核巨噬细胞、淋巴细胞为主的浸润；脑组织中C3表达降低(P<0.05)，MHCⅠ、MHCⅡ和IL-12蛋白表达增加(P<0.05)；IL-27和B7 mRNA表达增加(P<0.05)。结论 中枢神经系统内APC的活化、MHC分子、IL-12表达增加是EAE发生的早期事件并贯穿整个病理变化过程，由APC免疫应答引发的下游伴随事件可以造成EAE动物模型髓鞘直接损伤，APC可能是慢性EAE最终发生的最重要启动和致病因素之一。

实验性变态反应性脑脊髓炎；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白；抗原提呈细胞

多发性硬化(MS)是以神经退行性变及白质散在/多灶性髓鞘脱失为主要病理变化，可伴有不同程度轴索损伤的炎性自身免疫性疾病。MS发生的确切原因和病理机制迄今不明，对于MS/EAE的大量研究结果表明，似乎所有已知类型免疫细胞都与中枢神经系统的炎症和脱髓鞘病变存在关联[1]。实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)，是发生于各种敏感实验动物中枢神经系统的炎性变态反应性疾病。EAE模型在临床、生化、免疫及病理等诸多方面与MS具有更相似的特征，是当前公认的研究MS的发病机制和治疗策略的理想动物模型[2-3]。近年来MOG作为EAE模型的诱导抗原已被广泛应用于动物实验研究中，文献报道 MOG诱导C57BL/6小鼠的EAE模型在病理和临床表现上最接近于人类MS[4-5]。因此，本实验采用MOG35-55肽段主动免疫建立小鼠慢性-非缓解型EAE模型，观察模型动物在免疫应答不同阶段，尤其是疾病发生过程中重要时间点的变化，对抗原提呈细胞(APC)在EAE发生、发展过程中的作用及机制进行分析研究。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器：人工合成的鼠源性髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)多肽肽段，H-Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser-Pro-Phe-Ser-Aig-Val-Val-His-Leu-Tyr-Aig-Asn-Gly-Lys-OH，MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(Sigma)；百日咳毒素Pertussis Toxin，PTX(Sigma)；完全福氏佐剂Complete Freund’s Adjuvant(Sigma)；全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白含量测定试剂盒(凯基生物)；Ecl化学发光试剂盒(Thermo)；mRNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(Thermo)；蛋白电泳装置、凝胶成像系统(Bio Rad)；荧光定量PCR仪(ABI)。

1.2 实验动物及分组：114只健康8～10周龄雌性野生型C57BL/6小鼠，体重18～22 g，由武汉大学实验动物中心提供。在室温(25±2)℃、相对湿度50%～60%的环境中分笼饲养，人工昼夜循环照明环境中，适应性饲养1～2周后予以编号分组。将小鼠随机分为3组：对照组，佐剂组，自然病程组(EAE组)。

1.3 模型制作：EAE模型组小鼠分2点腹股沟皮下注射0.2 mL混合乳剂，其中含人工合成的MOG35-55肽段250 μg，完全弗氏佐剂2 mg；注射当天和2 d时经腹腔注射百日咳毒素200 ng，1周后重复免疫注射1次。对照组小鼠正常饲养，不给予任何干预。佐剂组小鼠给予同剂量完全弗氏佐剂和百日咳毒素，但不进行M0G35-55肽段免疫诱导。

1.4 临床评分：从免疫当天计第0天起，至第42天实验终止前，每天观察小鼠行为活动，采用盲法，每天2人至少1次在同1时间依据Benson评分标准做EAE临床症状严重程度评估。评分标准：0分，正常无症状；1分，尾部无力或跳踞步态伴尾部有力；2分，跳踞步态伴尾部无力；2.5分，共济失调伴部分单肢麻痹；3分，单肢完全麻痹；3.5分，单肢完全麻痹伴另一肢体部分麻痹；4分，双肢完全麻痹；4.5分，四肢麻痹；5分，死亡。未发病或死亡标本自动剔除。

1.5 标本制备：分别在动物固有免疫期(免疫后3 d)、发病前期(免疫后10～12 d)、发病初期(免疫后15～20 d)、发病高峰期(免疫后24～28 d)和慢性维持期(免疫后第42天)处死动物，取组织进行相关检测。

1.6 HE染色观察小鼠脑组织病理变化：将石蜡包埋的组织切片，片厚4 μm，进行HE染色，镜下观察脑组织炎症病灶范围和细胞浸润的情况。

1.7 Werstern blot检测小鼠脑组织APC相关蛋白表达：将各组小鼠脑组织匀浆行BCA法测定浓度后，等浓度稀释，上样，SDS-PAGE凝胶电泳。采用湿转法将蛋白转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭抗原1 h后，分别孵育兔抗GAPDH抗体1∶10 000，兔抗C3抗体1∶1 000，MHC-Ⅰ抗体1∶3 000，MHC-Ⅱ抗体1∶1 000，IL-12抗体1∶500，4 ℃摇床过夜。HRP标记的山羊抗兔二抗(1∶5 000)室温孵育60 min，ECL发光，暗室胶片曝光并进行扫描分析。

1.8 荧光定量PCR检测小鼠脑组织IL-27、B7-1 mRNA的表达：分别取100 mg脑组织，按RNA提取试剂盒说明书提取各组织总mRNA，按逆转录试剂盒说明书进行2 μg总mRNA 20 μl体系逆转录。通过引物设计软件Primer 5设计小鼠目的基因(IL-27、B7-1)和内参基因(β-actin)引物序列，引物由Invitrogen中国公司合成，见表 1。荧光定量PCR扩增体系(25 μl)：2×Master Mix 12.5 μl，上游引物(10 μM) 0.5 μl，下游引物(10 μM)0.5 μl，cDNA模板500 ng，加RNase-Free water至25 μl。反应条件:95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s→58 ℃退火30 s→72 ℃延伸30 s(40个循环)。目的基因表达的定量分析采用样本的CT值，以小鼠的β-actin基因作为内参，采用2-△△Ct法计算小鼠脑组织IL-27、B7-1基因mRNA的相对表达量。

1.9 统计学方法：采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

表1 目的基因及内参基因引物序列及产物片段长度

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况比较：对照组和佐剂组小鼠无体重下降，反应活跃，食欲佳。EAE组小鼠免疫诱导后至发病前期体重一过性下降，活动减少，反应迟缓，食欲差；临床症状表现多样、较严重，发病小鼠的临床症状持续直至实验结束。临床评分随着时间逐渐增高，EAE组自发病初期至慢性维持期平均临床评分与对照组和佐剂组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 病理组织学观察：对照组和佐剂组小鼠脑HE染色未发现异常改变。EAE组小鼠随着病情的进展，炎症病灶范围和细胞浸润的程度也相应增加，在发病高峰期可见血管周围炎性细胞浸润，浸润的炎性细胞主要是单核细胞和淋巴细胞，但炎性细胞浸润程度并不十分严重，在慢性维持期病理改变上有所减轻，见图1-图6(目录后)。

2.3 Western blot检测小鼠脑组织中C3、MHC Ⅰ、MHC Ⅱ、IL-12蛋白的表达：补体C3在脑组织中的含量在固有免疫期有所升高，之后呈逐渐下降趋势，固有免疫期和发病前期与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，发病初期、高峰期和慢性维持期较对照组降低(P<0.05)；MHC Ⅰ类分子在EAE模型组小鼠脑组织内的含量随病程发展明显增多，发病初期、发病高峰期、慢性维持期与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；慢性维持期较发病高峰期表达增加，二者间差异有统计学意义(P<0.05)；EAE 组小鼠从发病前期开始MHC Ⅱ类分子表达增加，至发病初期含量达到高峰，在发病高峰期有所下降，至慢性维持期再度升高，发病前期、发病初期、发病高峰期和慢性维持期较对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；慢性维持期较发病高峰期MHC Ⅱ类分子表达增加，二者间差异有统计学意义(P<0.05)。IL-12在脑内的分泌自发病前期开始增加，至发病高峰期达到最大值，至慢性维持期仍处于较高水平，发病前期、发病初期、发病高峰期和慢性维持期IL-12的含量较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 PCR检测小鼠脑组织IL-27、B7-1 mRNA的表达：与对照组比较，EAE组小鼠脑内IL-27 mRNA的表达在固有免疫期和发病前期下调(P<0.05)，发病初期表达明显增加，至发病高峰期仍维持较高水平(P<0.05)，在慢性维持期表达显著减少(P<0.05)；B7-1 mRNA的表达随病程发展呈逐渐升高趋势，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

有研究表明，MS/EAE发生、发展可能涉及过度且持续异常激活的固有免疫应答、适应性免疫应答状态和机体免疫耐受机制被动终止等多个因素。抗原进入体内首先在局部产生固有免疫应答反应，绝大多数抗原不能直接激活特异性的效应淋巴细胞，而是必须由APC将抗原降解加工成可与MHC分子牢固结合的多肽片段，同时还表达协同刺激分子如B7分子，再以抗原肽-MHC复合物的形式提呈给T淋巴细胞供其充分活化。APC可能是EAE小鼠免疫应答由外周免疫系统辗转至中枢神经系统的重要载体，正常组织或静息状态的APC不表达或低表达共刺激分子，专职APC活化后通过表达共刺激分子来提示机体受到侵害，这时诱发的抗原特异性免疫应答才具有针对性。许多研究显示，固有免疫系统里许多细胞如DC、巨噬细胞、NKT等都可以通过下调共刺激分子表达诱导免疫耐受[6]，可见APC在MS/EAE免疫病理中的重要作用[7]。

补体系统是机体重要的免疫应答和免疫效应联络、放大系统，不仅是固有免疫的重要效应机制，同时也是适应性免疫的重要效应机制之一。补体活化过程中产生的活性片段，可介导多种生物学效应。补体C3可直接参与免疫应答过程，主要促进APC的抗原摄取、加工。Western结果显示，EAE模型组小鼠脑内补体C3的含量在固有免疫期未见明显变化，至发病初期C3含量显著降低，表明这时补体系统激活反应已不明显，固有免疫不再占主导地位。

其他实验结果显示，在慢性EAE发病前期，与APC活化、抗原提呈有关的MHC Ⅱ类分子、B7-1分子、IL-12表达增加，至发病初期几乎所有APC功能相关因子的表达变化已非常显著；可见中枢神经系统内APC激活是慢性EAE免疫应答的早期事件，这时中枢神经系统组织损伤已经开始产生，其作用可能早于T淋巴细胞在中枢神经系统和周围免疫系统分化、增殖及激活后产生的细胞免疫反应。在随后的过程中，脑组织内MHC Ⅰ、MHC Ⅱ类分子、B7-1、IL-12的表达均保持较高的水平，提示脑内APC处于较高的活化状态，且这种活化状态一直持续到实验结束，其原因除了需要提呈的抗原始终大量存在外，或许还与APC的负反馈调节机制不能发挥有效作用有关。EAE组小鼠脑内IL-27在发病初期分泌达到高峰，且在发病高峰期维持较高水平，但在慢性维持期明显下降，推测慢性维持期时IL-27与IL-12的协同效应已经减弱，IL-12却仍在维持其功能效应。以上实验结果均说明，APC显著增强的活化效应一直贯穿于慢性EAE发展的全过程。

总结以上分析，慢性EAE的最终发生与多种细胞反应以及它们分泌的细胞因子均存在关联性。补体系统激活、APC活化后持续提呈抗原和分泌促炎细胞因子在病程早期发生，这些以APC为核心的固有免疫应答效应一直持续影响疾病的发生。APC可以影响免疫应答的强度并决定应答的方向，因此APC活化可能是最终造成髓鞘损伤最早启动因子之一和直接、必须的参与因素。

[1] Murphy AC，Lalor SJ，Lynch MA，et al.Infiltration of Th1 and Th17 cells and activation of microglia in the CNS during the course of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Brain Behavior and Immunity，2010，24(4):641-651.

[2] Kanamori M，Kawaguchi T，Nigro JM，et al.Contribution of notch signaling activation to human glioblastoma multiforme[J].Journal of Neurosurgery，2007，106(3):417-427.

[3] Rao P，Segal BM.Experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Methods Mol Med，2004，102:363-375.

[4] Roscoe WA，Welsh ME，Carter DE，et al.VEGF and angiogenesis in acute and chronic MOG(35-55) peptide induced EAE[J].Journal of Neuroimmunology，2009，209(1/2):6-15.

[5] Berard JL，Wolak K，Fournier S，et al.Characterization of relapsing remitting and chronic forms of experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice[J].Glia，2010，58(4):434-445.

[6] Lehuen A，Diana J，Zaccone P，et al.Immune cell crosstalk in type 1 diabetes[J].Nature Reviews Immunology，2010，10(7):501-513.

[7] Wiesemann E，Deb M，Trebst C，et al.Effects of interferon-beta on co-signaling molecules:upregulation of CD40,CD86 and PD-L2 on monocytes in relation to clinical response to interferon-beta treatment in patients with multiple sclerosis[J].Multiple Sclerosis，2008，14(2):166-176.

The study of immune response of APC in different stage of Chronic EAE

CAOYikun,LIUFengying,HUABing,ZHOUXiangyu.

DepartmentofNeurology,TheFirstHospitalofShizuishanAffiliatedofNingxiaMedicalUniversity,Shizuishan753600,ChinaCorrespondingouthor:ZHOUXiangyu,Email:zxy839698@163.com

Objective To analyze the pathological changes in different periods of MOG35-55 peptide -induced EAE mice,trying to in order to reveal the role and its mechanism of difference immune responses during the occurrence,development and persistent process of EAE.Method MOG35-55 peptide as an immunogen induced C57BL/6 mice to produced chronic non-remitting EAE model.We used the method of histopathological to observe the changes in neurological function at different times of experimental animals,at the same time,Western blot,and RT-PCR technologies were used to detect some important indicators of immune parameters and make a comprehensive analysis.Result The study found that MOG35-55 peptide can be successfully induced the chronic non-remitting EAE animal model.Compared with control group,lymphocyte and mononuclear macrophages of proliferation and infiltrating;The expression of C3 protein were decreased in brain (P<0.05),the expressions of MHCⅠ、MHCⅡ and IL-12 protein were increased (P<0.05);the expressions of IL-27 and B7 mRNA were increased (P<0.05).Conclusion The activation of the APC,increased expression of MHC molecule and IL-12 in the central nervous system is an early event in EAE and throughout the entire process of its pathological changes.Downstream events caused by immune responses of the APC can cause EAE animal model myelin damage directly,the APC is probably the most important start and pathogenic factor for the chronic EAE happened eventually.

Experimentalallergicencephalomyelitis;Myelinoligodendrocyteglycoproteinfusionimmunoglobulin;Antigen-presentingcells

国家自然科学基金地区科学基金项目(81660212)

宁夏石嘴山市第一人民医院神经内科，宁夏 石嘴山 753600

曹羿堃(1989-)，男，硕士学位，住院医师，主要从事神经变性疾病研究方向。

周翔鱼，Email:zxy839698@163.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170215.1139.002.html

10.13621/j.1001-5949.2017.02.0100

R332

A

2016-07-15 [责任编辑]李 洁