一种新型融合免疫球蛋白-mGE对慢性小鼠EAE治疗作用的分析评估

程秀丽，张志红，刘风英，马云亭，华 冰，周翔鱼

·论 著·

一种新型融合免疫球蛋白-mGE对慢性小鼠EAE治疗作用的分析评估

程秀丽，张志红，刘风英，马云亭，华 冰，周翔鱼

目的 利用一种新型融合免疫球蛋白-mGE对实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)进行治疗并评估疗效，以期能够为单独或联合其他药物治疗此病提供新的思路和方法。方法 MOG35-55肽段诱导C57BL/6小鼠制作慢性非缓解型EAE模型成功后，随机抽取部分模型小鼠，利用一种新型IgG-IGE的Fc段融合免疫球蛋白进行治疗，观察临床体征及组织病理变化情况，同时检测一些重要的免疫相关指标并加以比对分析。结果 mGE可以通过降低抗原提呈细胞(APC)的主要组织相容性复合物(MHC)类分子，上调抑制性Fc受体CD32的表达从而阻断APC抗原提呈及淋巴细胞激活，明显缓解慢性EAE的神经功能损害症状。结论 mGE可以通过减少APC抗原提呈而缓解慢性EAE的神经功能损伤症状。mGE治疗慢性非缓解型EAE的作用确切，可作为单独或联合其他药物治疗EAE的备选方法之一。

实验性变态反应性脑脊髓炎；抗原提呈细胞；主要组织相容性复合物；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白；融合免疫球蛋白

多发性硬化(MS)是一类临床表现和病理改变复杂多样，病程及预后千差万别，至今仍无法治愈的中枢神经系统疾病。目前治疗的一线药物为糖皮质激素、β干扰素(IFN-β)等，糖皮质激素由于诸多毒副作用和反弹现象使治疗效果不佳，IFN-β则因价格昂贵限制其广泛使用。近年来的动物实验和临床研究都显示，B淋巴细胞可能参与MS/EAE发生和发展的诸多环节。多个实验研究证实[2-4]应用这种融合免疫球蛋白能够使CD32b和FcεRI发生聚集，激活FcεRI相关Lyn的抑制信号，从而导致CD32b的ITIM的酪氨酸迅速磷酸化而抑制肥大细胞和嗜碱性粒细胞的脱颗粒反应及B细胞分泌抗体向IgE的类别转换。这些实验同时也证实mGE是一种具有剂量依赖效应，无明显不良反应的融合免疫球蛋白。本实验通评估新型融合免疫球蛋白-mGE对EAE治疗作用，以期能够为单独或联合其他药物治疗本病提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂：融合蛋白mGE由祝道成教授惠赠，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白，百日咳毒素 (PTX)，弗氏完全佐剂，小牛血清白蛋白。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物与分组：72只健康8～10周龄雌性野生型C57BL/6小鼠，体重18～22 g，由武汉大学实验动物中心提供，在室温18～25 ℃、相对湿度50%～60%，分小笼全价营养饲料饲养。人工24 h昼/夜循环照明环境中，适应性饲养1～2周后予以编号分组。随机分为EAE自然病程组、糖皮质激素治疗组和融合蛋白治疗组，在造模成功后发病高峰期分别腹腔注射给予生理盐水、甲泼尼龙5 mg/kg和mGE2 mg/kg，每日1次，连续治疗7 d并继续观察1周评价疗效。于免疫后第42天处死动物进行相关检测。

1.2.2 EAE模型的制作：采用M0G35-55肽段及免疫佐剂制作慢性EAE动物模型。每只小鼠分2点腹股沟皮下共注射0.2 mL混合乳剂，其中含人工合成的MOG35-55肽段250 μg，完全弗氏佐剂2 mg，免疫0 d和2 d时经腹腔各注射百日咳毒素200 ng。1周后重复免疫注射1次。分别在动物发病高峰期(免疫后24～28 d)和慢性维持期(免疫后第42天)以每组12只处死动物，取组织进行相关检测。由于小鼠存在个体差异，出现未发病或死亡的样本则自动剔除。

1.2.3 实验小鼠不同阶段的临床评分：从初次免疫第0天起至第42天实验终止前，采用盲法，每天2人至少一次在同一时间进行神经功能评分，对EAE严重性进行临床评估。评分标准：0分，正常无症状；1分，尾部无力或跳踞步态伴尾部有力；2分，跳踞步态伴尾部无力(共济失调)；2.5分，共济失调伴部分单肢麻痹；3分，单肢完全麻痹；3.5分，单肢完全麻痹伴另一肢体部分麻痹；4分，双肢完全麻痹；4.5分，四肢麻痹；5分，死亡。

1.2.4 免疫荧光组化检测小鼠脾脏内IFN-γ的表达：取小鼠脾脏进行石蜡包埋切片，进行荧光免疫组化，检测小鼠脾脏内IFN-γ的表达。

1.2.5 Western blot检测小鼠脑内CD32b、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达：在造模第42天结束后，取小鼠脑组织，加入蛋白裂解缓冲液，提取待测脑组织总蛋白，经 10 % 变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，采用湿法将蛋白质转移至PVDF膜上，封闭后加入抗CD32b、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ及GAPDH一抗，4 ℃过夜后加二抗孵育 2 h，Chemi Doc XPS发光系统显影。以 Image J图像分析软件对图像进行分析，以目的条带与GAPDH光密度的比值作为蛋白表达相对含量。

1.3 统计学方法：采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以±s表示，比较采用配对t检验进行分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验小鼠不同阶段的临床评分：在经过激素和融合蛋白治疗后，2组小鼠临床功能评分均有明显下降，相对于EAE自然病程组差异有统计学意义(P<0.05)，表明治疗能够缓解神经功能的损伤程度。为剔除EAE组症状自然缓解的因素影响，实验结束时的评分对比表明，2治疗组较EAE组慢性缓解期仍有好转，差异有统计学意义(P<0.05)；但2治疗组间差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 3组实验小鼠不同阶段临床评分(分，±s)

表1 3组实验小鼠不同阶段临床评分(分，±s)

组别n发病高峰期慢性维持期EAE自然病程组243．5±0．71．6±0．3糖皮质激素治疗组243．2±0．30．7±0．2∗#融合蛋白治疗组243．6±0．20．9±0．4∗#

注：*与EAE自然病程组发病高峰期比较，P<0.05；#与EAE自然病程组慢性维持期比较，P<0.05。

2.2 小鼠脾脏内IFN-γ的表达：见图1-图4(目录后)。经过甲泼尼龙治疗后，小鼠脾脏内IFN-γ的荧光显色较EAE组发病高峰期和慢性维持期有显著减少，经mGE治疗后显色差异不及甲泼尼龙治疗组显著。

2.3 CD32b、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ在小鼠脑内的表达

2.3.1 CD32b在脑内的表达:经治疗后，甲泼尼龙组表达较发病高峰期无明显变化，但较慢性维持期降低且差异有统计学意义(P<0.05)；而融合蛋白治疗组变化明显，较发病高峰期和慢性维持期均增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图5(目录后)。

2.3.2 MHC-Ⅰ分子在小鼠脑内表达:见图6(目录后)。脑内MHC-Ⅰ类分子在慢性维持期仍处于高水平表达，经过甲泼尼龙和融合蛋白治疗后表达下降，与慢性缓解期比较差异有统计学意义(P<0.05)，说明甲泼尼龙和融合蛋白均可以降低脑内MHC-Ⅰ类分子的表达。

2.3.3 MHC-Ⅱ分子在小鼠脑内表达:见图7(目录后)。脑内MHC-Ⅱ类分子同样在慢性维持期仍处于高位，表明MHC-Ⅱ类分子在EAE中存在持续高表达，这与病程迁延不愈相一致。经过干预治疗后，甲泼尼龙组和融合蛋白组均较慢性维持期含量下降，差异有统计学意义(P<0.05)，提示甲泼尼龙和融合蛋白都有抑制MHC-Ⅱ类分子表达的作用。

3 讨论

APC是调节免疫反应方向和产生免疫耐受所必需的调节器，在维持免疫耐受中起到关键作用[5]。研究发现，EAE动物中枢神经系统中小胶质细胞表达MHC-Ⅱ类分子，且应用INF-γ诱导MHC-Ⅱ类分子表达能加重EAE病情，而应用IL-4、IL-10及TGF-β可抑制MHC-Ⅱ类分子表达并有助于EAE恢复[6]，这与本实验前期所得出的APC抗原提呈及炎性细胞因子分泌是参与EAE的重要机制这个结论一致。基于对MS/EAE发病机制多样化观点的认同，即多种类型免疫应答、多种免疫细胞参与和不同作用机制共同导致疾病发生，因此我们把治疗的靶点设为免疫细胞的CD32b，通过增强其表达或功能而缓解MS/EAE的损伤症状。本实验也证实通过这一途径，mGE具有明确的缓解慢性EAE小鼠临床功能损害的作用，治疗过程中没有出现激素样停药反弹现象。

甲泼尼龙是目前治疗MS急性期的首选药物，疗效较为确切，但是甲泼尼龙具有广泛而严重的毒副作用，患者的耐受性差异较大，难以长期使用，停药后的反弹现象也经常出现，这些限制促使研究者一直努力寻找一种更加有效、特异性更高并且毒副作用低的药物替代或联合治疗MS。本实验中对结果分析发现，甲泼尼龙能够减少MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子，但没有发现对CD32b表达有影响作用。

虽然mGE与甲泼尼龙的作用机制存在差异，临床功能评分改善并不优于甲泼尼龙组，但是实验结果显示mGE可以显著降低MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子和抗原提呈功能相关免疫分子水平；说明mGE可以通过促进CD32b表达上调，阻断APC诱导的T、B淋巴细胞激活来实现其治疗作用。

综上所述，融合蛋白mGE可以降低慢性EAE小鼠脑内MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子和脾脏INF-γ的表达，增加CD32b的表达；甲泼尼龙则能够减少MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子，下调脾脏INF-γ的表达，即融合蛋白和甲泼尼龙都具有下调脑内APC提呈相关主要因子MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子。融合蛋白对能够上调抑制性受体CD32b的表达，表现出对APC活化的多重阻遏作用，但未见对T淋巴细胞相关免疫应答有显著作用。而甲泼尼龙除了能够抑制APC相关作用外，还表现出对T细胞免疫应答很强的负向抑制性调节作用，这是二者之间治疗作用机制上的主要区别。

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Assessment the treatment of chronic EAE mice in a new fusion immunoglobulin-mGE

CHENGXiuli,ZHANGZhihong,LIUFengying,MAYunting,HUABing，ZHOUXiangyu.

DepartmentofNeurology,TheFirstHospitalofShizuishanAffiliatedofNingxiaMedicalUniversity,Shizuishan753200,ChinaCorrespondingauther：ZHOUXiangyu,Email：zxy839698@163.com

Objective To treat EAE and evaluate its efficacy,in order to provide new ideas and methods to treat the disease in alone or combinated with other drugs.Methods After C57BL/6 mice had been produced the chronic non-remitting EAE model induced by MOG35-55 peptide successfully,randomly selected portion of some mice when they were in the peak of onset,a novel fusion immunoglobulin which structre is combined with Fc portion of IgG and IgE and acid methyl prednisolone were used to treatment,then we observed the changes in clinical signs,simultaneous detection of a number of important immune-related indicators and made the relative analysis and the evaluated treatment efficacy of this fusion immunoglobulin to EAE mice.Results mGE playsed a therapeutic role by decreaseing the activity of the complement system generates fragments,inhibiting APC antigen presentation,reduceing the expression of MHC,and raiseding the expression of inhibitory Fc receptor- Fc gamma RII,blocking the APC antigen presenting and lymphocyte activation.Conclusion The treatment effect of mGE is exactly in the chronic non-remitting EAE,as one of alternative methods alone or in combination with other drugs for the treatment of EAE.mGE can inhibit MHC molecules expression of APC, and decrease the inflammatory cytokine release to ease chronic neurologic injury symptoms of EAE.

Experimentalallergicencephalomyelitis;Antigen-presentingcells;Majorhistocompatibilitycomplex;Myelinoligodendrocyteglycoprotein;Fusionimmunoglobulin

10.13621/j.1001-5949.2017.02.0104

国家自然科学基金地区科学基金项目(81660212)

宁夏石嘴山市第一人民医院神经疾病研究中心,宁夏 石嘴山 753200

程秀丽(1991-)，女，硕士学位，初级药师，主要从事神经疾病研究方向。

周翔鱼，Email:zxy839698@163.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170215.1139.004.html

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2016-06-15 [责任编辑]王凯荣