131I-Herceptin对高表达HER-2/neu肺癌细胞增殖的影响

王 莹，赵 倩，庄晓青，李 娟

·论 著·

131I-Herceptin对高表达HER-2/neu肺癌细胞增殖的影响

王 莹，赵 倩，庄晓青，李 娟

目的 探讨131I-Herceptin对高表达HER-2/neu肺癌细胞增殖的影响。方法 应用Iodogen法制备131I-Herceptin，用TLC测定标记率及放化纯。实验设131I-Herceptin组、Herceptin组、131I组和生理盐水对照组。根据药物浓度及131I 的放射性活度分为三组：低剂量组：5 kBq131I-Herceptin、5 μg/μl Herceptin、5 kBq131I和生理盐水；中剂量组：10 kBq131I-Herceptin、10 μg/μl Herceptin、10 kBq131I和生理盐水；高剂量组：20 kBq131I-Herceptin、20 μg/μl Herceptin、20 kBq131I和生理盐水。MTT法检测各组对人肺腺癌Calu-3细胞的生长抑制作用。结果131I-Herceptin的标记率为(78.3±3.2)%，分离纯化后放化纯为(93.8±3.4)%。131I-Herceptin对人肺腺癌Calu-3细胞的免疫结合率为(61.8±2.8)%。5、10、20 kBq131I-Herceptin人肺腺癌Calu-3细胞抑制率，分别为(36.7±2.5)%、(40.3±3.2)%、(43.6±3.5)%；质量浓度为5 μg/μl、10 μg/μl、20 μg/μl的未标记Herceptin抑制率，分别为(28.3±3.0)%、(30.5±2.6)%、(32.4±2.4)%；5、10、20 kBq131I抑制率，分别为(8.3±1.8)%、(9.8±1.0)%、(11.2±2.3)%；生理盐水对照组自然凋亡率为(3.5±0.6)%。131I-Herceptin、Herceptin、131I不同浓度间的细胞抑制率差异有统计学意义(P<0.05)。131I-Herceptin高剂量组的细胞抑制率高于低剂量组、中剂量组(P<0.05)。高剂量组：131I-Herceptin组的细胞抑制率最高，与Herceptin组的差异有统计学意义(P<0.05)；与131I组、对照组的差异有统计学意义(P<0.05)。结论131I-Herceptin能与人肺腺癌Calu-3细胞特异性结合，并对人肺腺癌Calu-3细胞增殖有显著的抑制作用。

肺癌；131I-Herceptin；HER-2/neu；抑制率

肺癌的发病率和死亡率迅速上升，其中约80%是非小细胞肺癌[1]。近年来有文献报道，非小细胞肺癌存在HER-2/neu的过量表达[2]。曲妥株单抗(Herceptin)是一种针对癌基因HER-2/neu的表达蛋白p185设计的人化鼠嵌合型抗体[3]。131I标记的Herceptin对HER2/neu的表达有一定的抑制作用，在对乳腺癌及卵巢癌等细胞增殖影响[4-5]的研究中得以证实，但是131I-Herceptin对高表达HER2/neu肺癌细胞增殖影响的研究却很少见。本研究旨在观察131I-Herceptin对高表达HER-2/neu的人肺腺癌Calu-3细胞增殖能力的影响，为肺癌放射免疫治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 一般材料：人肺腺癌Calu-3细胞、人肺腺癌A549细胞购于中国医学科学院肿瘤细胞库。Herceptin、四甲基偶氮唑蓝液(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)均购于Sigma公司。无载体Na131I放射性浓度为555 MBq/mL，为北京原子高科股份有限公司产品。HERA cell 150 CO2培养箱为美国THERMO公司产品。SN-697型γ放射免疫计数器购于上海核所日环光电仪器有限公司。BIOSCAN TLC薄层放射性扫描仪购自于美国BIOSCAN公司。

1.2 方法

1.2.1131I-Herceptin的制备[6]：应用Iodogen法进行131I-Herceptin标记。取50 μl Herceptin (20 mg/mL)置于提前制备好的Iodogen涂管中，并将涂管置于冰上。依次加入100 μl PBS(0.01 mol/L)、100 μl Na131I (555 MBq/mL)混匀，震荡反应30 min。吸出反应液来终止反应，并应用TLC测定标记率。采用Sephadex G50柱凝胶过滤法对131I-Herceptin分离纯化，再用TLC测定标记率及放化纯。

1.2.2131I-Herceptin与人肺腺癌Calu-3细胞的免疫结合率测定：将培养好的人肺腺癌Calu-3细胞制成细胞悬液，取适量置于微量离心管中，1×105个细胞/管，加入20 kBq131I-Herceptin，混匀后，在温度为37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养4 h，测定总放射性计数T。然后进行离心，以1 000 r/min离心5 min，用磷酸盐缓冲液冲洗3遍，测定沉淀细胞的放射性计数B。免疫结合率=B/T×100%，重复测定4次。对照组为人肺腺癌A549细胞，方法同上。

1.2.3 人肺腺癌Calu-3细胞抑制率的检测[5]：采用MTT法。取上述细胞悬液接种于24孔培养板中，置于培养箱中24 h，次日取出。实验分为4组，每组设3个复孔，131I-Herceptin组，分别加入5、10、20 kBq的131I-Herceptin；Herceptin组，分别加入质量浓度5 μg/μl、10 μg/μl、20 μg/μl的Herceptin 100 μl；131I组，分别加入5、10、20 kBq的131I；另设置空白对照组，加入0.9%生理盐水100 μl。将5 kBq131I-Herceptin、5 μg/μl Herceptin、5 kBq131I归为低剂量组；10 kBq131I-Herceptin、10 μg/μl Herceptin、10 kBq131I归为中剂量组；20 kBq131I-Herceptin、20 μg/μl Herceptin、20 kBq131I归为高剂量组。将以上各亚组分别再次放置于培养箱中，48 h后取出，再加入20 μl /孔MTT培养4 h，吸弃上清液，加入DMSO 150 μl/孔，避光充分振荡10 min后，采用酶标仪在波长490 nm处检测各组的吸光度(A)值。重复上述实验3次。

1.3 统计学方法：资料使用SPSS19.0 统计软件，计量资料用±s表示，多组间参数采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1131I-Herceptin的标记率、放射化学纯度：131I-Herceptin的标记率为(78.3±3.2)%。经过Sephadex G50柱分离纯化后，测得131I-Herceptin放化纯为(93.8±3.4)%。

2.2131I-Herceptin免疫结合率：131I-Herceptin对人肺腺癌Calu-3细胞的免疫结合率为(61.8±2.8)%；131I-Herceptin对人肺腺癌A549细胞的免疫结合率为(8.9±1.2)%。

2.3 对人肺腺癌Calu-3细胞抑制作用的比较：MTT法具体检测结果，随着药物浓度和131I放射性活度的增加，细胞抑制率也逐渐增加。131I-Herceptin、Herceptin、131I不同浓度间的细胞抑制率比较差异有统计学意义(F=65.84、92.68、73.56，P<0.05)。131I-Herceptin高剂量组的细胞抑制率高于低、中剂量组(t=8.20、6.70，P<0.05)。高剂量组：131I-Herceptin组的细胞抑制率最高，与Herceptin组比较差异有统计学意义(t=2.29，P<0.05)；与131I组、对照组的差异有统计学意义(t=10.65、21.16，P<0.05)，见表1。

表1 不同药物及浓度对人肺腺癌Calu-3细胞抑制率的比较(%，±s)

表1 不同药物及浓度对人肺腺癌Calu-3细胞抑制率的比较(%，±s)

组别n131I-Herceptin组Herceptin组131I组对照组低剂量组336．7±2．528．3±3．08．3±1．83．5±0．6中剂量组340．3±3．230．5±2．69．8±1．03．5±0．6高剂量组343．6±3．532．4±2．411．2±2．33．5±0．6F值65．8492．6873．56P值<0．05<0．05<0．05

3 讨论

目前肺癌的治疗方法仍以手术、化疗和放疗为主，但其总体治疗效果却并不理想。近年来，分子靶向治疗成为肿瘤治疗的热点，而放射免疫治疗则是在分子靶向治疗基础上发展起来的又一新型肿瘤治疗模式。Herceptin主要适用于HER-2/neu过度表达的乳腺癌患者，并且已证实131I标记的Herceptin对高表达HER-2/neu的乳腺癌、胃癌及卵巢癌均有较好的效果，其效果优于未标记的Herceptin[4-5,7]。

鳞癌、腺癌和大细胞癌均存在HER-2/neu蛋白的过量表达。有文献报道，人肺腺癌Calu-3细胞存在HER2/neu的过度表达，与乳腺癌SKBr3细胞相似，而人肺腺癌A549细胞HER2/neu表达较弱[8]。故本研究中选用人肺腺癌Calu-3细胞，重点分析131I-Herceptin对高表达HER2/neu的人肺腺癌Calu-3细胞增殖的影响。

131I标记蛋白质的技术比较成熟，成功标记后在体外能够取得较好的稳定性。有文献证实，经131I标记后，Herceptin的免疫反应活性未发生明显变化[5]。本研究中，采用Iodogen法将放射性核素131I标记于Herceptin上，能获得较稳定的标记率(78.3±3.2)%，分离纯化后能够应用于肿瘤的显像和治疗。本研究中成功标记131I-Herceptin后，进行了与人肺腺癌Calu-3细胞结合能力的检测，结果显示，其免疫结合率为(61.8±2.8)%；而对于低表达HER-2/neu的人肺腺癌A549细胞，其免疫结合率只有(8.9±1.2)%，说明人肺腺癌Calu-3细胞对131I-Herceptin的摄取良好。结果与张龙杰等[6]的研究报道相似。

本研究用MTT法对人肺腺癌Calu-3细胞抑制率进行了检测，结果显示，131I-Herceptin高剂量组的细胞抑制率高于低剂量组、中剂量组(P<0.05)；高剂量组中131I-Herceptin的细胞抑制率最高，与Herceptin组、131I组、对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。131I-Herceptin和Herceptin都对人肺腺癌Calu-3细胞的增殖有一定抑制作用，主要是基于Herceptin的分子靶向治疗机制，但是131I-Herceptin的细胞抑制作用明显高于Herceptin，且细胞抑制率随着靶向药物的浓度及放射性活度的增加而增高；分析结果可能为131I衰变产生的β射线会对肿瘤细胞产生辐射生物效应，而Herceptin能选择性地作用于人表皮生长因子受体-2(HER2)的细胞外部位，发挥放射性免疫治疗效果，将131I核素标记于Herceptin，131I会伴随Herceptin浓聚于肿瘤组织并杀伤肿瘤细胞，将131I核素的辐射生物效应与Herceptin的放射性免疫治疗相结合，可达到增益治疗的效果。而单纯131I组由于无Herceptin分子靶向作用的引领，其辐射生物效应也未能达到预期的效果。

综上所述，131I-Herceptin能与人肺腺癌Calu-3细胞特异性结合，对其细胞增殖有一定抑制作用，为后期的动物实验与临床应用奠定了基础。

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Inhibitory effects of 131I-Herceptin on overexpressedHER-2/neu overexpressed in lung cancer cell

WANGYing,ZHAOQian,ZHUANGXiaoqing,LIJuan.

DepartmentofNuclearMedicine,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China

Objective To explore the inhibitory effects of131I-Herceptin on overexpressed HER-2/neu overexpressed in lung cancer cell.Methods Herceptin was labeled with131I using the Iodogen method.The radiolabeling efficiency and radiochemical purity were characterized by TLC in vitro.There were four groups including131I-Herceptin,Herceptin,131I and 0.9% sodium chloride solution group.It was divided into three groups according to the drug concentration and131I radioactive activity.5kBq131I-Herceptin,5μg/μl Herceptin,5kBq131I and physiological saline was classified as low dose group.10kBq131I-Herceptin,10μg/μl Herceptin,10kBq131I and physiological saline was classified as medium dose group.20kBq131I-Herceptin,20μg/μl Herceptin,20kBq131I and physiological saline was classified as high dose group.The inhibitory effects of different treatments on the proliferation of human lung adenocarcinoma cell line Calu-3 were measured by MTT assay.Results The labeled rate of131I-Herceptin was (78.3±3.2)%.The radiochemical purity of131I-Herceptin was (93.8±3.4)% after purification.The immune combination rate of131I-Herceptin was (61.8±2.8)% for lung adenocarcinoma cell line Calu-3.Cell inhibition rates of 5,10,20kBq131I-Herceptin to human lung adenocarcinoma Calu-3 were (36.7±2.5)%，(40.3±3.2)%，(43.6±3.5)% respectively.Cell inhibition rates of 5,10,20μg/μl Herceptin were (28.3±3.0)%,(30.5±2.6)%,(32.4±2.4)% respectively.Cell inhibition rates of 5,10,20kBq131I were (8.3±1.8)%,(9.8±1.0)%,(11.2±2.3)% respectively.Natural apoptosis rate of physiological saline was (3.5±0.6)%.The cell inhibition rate between different concentrations of131I-Herceptin,Herceptin,131I haved significant difference (P<0.05).Cell inhibition rate of high dose group of131I -Herceptin was higher than low and medium dose group(P<0.05).Cell inhibition rate of131I-Herceptin group was the highest in high dose group.It was statistically significant between131I-Herceptin and Herceptin (P<0.05).It was obviously statistically significant among131I-Herceptin,131I and physiological saline (P<0.05).Conclusion131I-Herceptin can bind to human lung adenocarcinoma Calu-3 with highly affinity and has significant inhibitory effect on the lung cancer cell line.

Lungcancer;131I-Herceptin;HER-2/neu;Inhibitionrate

10.13621/j.1001-5949.2017.02.0107

宁夏医科大学校级项目(XM201461)

宁夏医科大学总医院核医学科，宁夏 银川 750004

王莹(1983-)，女，河北籍，硕士研究生，主治医师，主要从事临床核医学诊断及治疗。

http://www.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170215.1139.006.html

R734.2

A

2016-04-26 [责任编辑]马兴忠