BRAF V600E突变与甲状腺乳头状癌侵袭性及超声特征的相关性研究

赵美丽，张文婷，常 隽，陈松旺，邵国强

1.南京医科大学附属南京医院（南京市第一医院）功能检查科，江苏 南京 210006；

2.南京医科大学附属南京医院（南京市第一医院）核医学科，江苏 南京 210006

近年来甲状腺癌的发病率越来越高，30年间甲状腺癌的发病率已升高近3倍［1］，新增的甲状腺癌中90%以上为甲状腺乳头状癌（papillary carcinoma of thyroid，PTC）［2］。部分甲状腺微小乳头状癌为惰性癌［3］，处于低风险状态［4］。PTC术后10年生存率能达到80%～90%，但仍有5%～30%的患者易出现颈部淋巴结转移和短期内复发［5］。BRAFV600E突变是甲状腺癌中最常见的一种基因突变形式，但关于BRAFV600E突变对PTC侵袭性价值及与超声特征的相关性尚存争议。本研究旨在探讨BRAFV600E突变在判断PTC侵袭性方面的价值及与甲状腺癌结节超声特征的相关性，完善BRAFV600E突变检测在PTC管理中的应用，更好地为临床诊治PTC提供参考。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选取2019年1月—2020年3月术前行常规超声检查、超声引导下细针抽吸细胞学检查（fineneedle aspiration biopsy，FNAC）及BRAFV600E检测，并经术后病理学检查证实为PTC的患者174例，将其分为突变组151例和无突变组23例，其中男性33例，女性141例，年龄23～75岁，平均年龄（45.2±11.3）岁。

研究对象纳入标准：① 甲状腺细胞病理学Bethesda报告系统（The Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology，TBSRTC）阳性；② TBSRTC阴性、不能确诊而BRAFV600E检测阳性者；③ 术后病理学检查、超声、TBSRTC及BRAFV600E检测资料完整者。排除标准：排除上述资料不完整者。本研究经医院伦理委员会审核通过，所有患者均签署知情同意书。

1.2 仪器与方法

1.2.1 常规超声检查方法

采用德国Siemens公司的Acuson Oxana 2彩色超声诊断仪，线阵探头频率为5～12 MHz，患者取仰卧位，进行甲状腺常规超声检查，记录可疑甲状腺癌结节位置、最大径、回声、边界、形态、纵横比、钙化、血流、后方衰减等超声特征。

1.2.2 超声特征描述要点

观察并记录甲状腺癌结节位置（按照结节位于甲状腺左或右叶上中下部，峡部，结节边缘是否贴近前后包膜、颈动脉、气管进行描述）、最大径、回声、边界、形态、纵横比（横断面测量纵径/横径）、钙化［6］（点状钙化及≥2 mm的粗大钙化）、血流（有，无）、衰减等声像图特点。

1.2.3 US-FNAC取材方法

由具有丰富穿刺经验的主治及以上医师进行穿刺操作。患者取仰卧位，充分暴露颈部，使用5 mL注射器连接7号穿刺针头，抽吸针管内0.5 mL负压，超声引导下对目标结节进行穿刺，每个结节穿刺3针，针头进入目标结节后在不同方向抽吸10～15次，当抽吸物到达针头与注射器衔接处时退针，前2针将抽取物注于载玻片上，推片后放入95%乙醇中湿固定后送病理科检查，行H-E染色，镜下观察。第3针抽取物注入装有基因保存液的瓶内，行BRAFV600E检测。

1.2.4 细胞学病理结果判读标准

参照TBSRTC 6分类标准［7］分为：Ⅰ类，标本无法诊断或不满意；Ⅱ类，良性病变；Ⅲ类，意义不明确的非典型病变或意义不明确的滤泡性病变；Ⅳ类，滤泡性肿瘤或可疑滤泡性肿瘤；Ⅴ类，可疑恶性肿瘤；Ⅵ类，恶性肿瘤。Ⅱ类记作阴性，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ类记作阳性，Ⅰ、Ⅲ类记作无法确诊。

1.2.5BRAFV600E基因突变检测方法

采用FFPE样本DNA分离试剂盒（厦门艾德生物科技医药有限公司，ADx-FF01）提取组织中的DNA，BRAFV600E点突变采用人类BRAF基因V600E突变检测试剂盒（厦门艾德生物科技医药有限公司，ADxBR01）提供的扩增受阻突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）法进行检测，均严格按照说明书步骤操作。BRAFV600E点突变判读标准：若样本的Ct值＜28认为存在点突变，否则为未突变。

1.3 统计学处理

使用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数表示，采用χ2检验进行分析；各指标对BRAFV600E突变的影响采用二元logistic回归分析。采用双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TBSRTC、BRAF V600E突变及术后病理学检查结果统计

术后病理学检查确诊的PTC共174例，TBSRTC阳性158例，阴性11例，不能确诊5例，诊断准确度90.80%（158/174）。BRAFV600E突变151例，无突变23例，突变率86.78%（151/174）。TBSRTC检测11例阴性及5例不能确诊患者均发生了BRAFV600E突变，术后病理学检查亦证实其为PTC。

2.2 BRAF V600E突变与各临床病理学及超声特征比较

突变组与无突变组比较显示，BRAFV600E突变与各临床病理学特征差异均无统计学意义（P＞0.05，表1）；与部分超声特征（位置、结节最大径、钙化、后方衰减）差异有统计学意义（P＜0.05），表明这4个超声特征与BRAFV600E突变有一定相关性，结节最大径≤5 mm、无钙化、后方无衰减、贴近前包膜的结节BRAFV600E突变概率较大（表2、3）。

表1 两组各临床病理学特征比较n（%）

表2 两组超声位置特征比较n（%）

表3 两组其他超声特征比较n（%）

2.3 二元logistic回归分析结果

二元logistic回归分析表明，只有结节的钙化及位置是与BRAFV600E突变的独立危险因素，无钙化或贴近前包膜PTC结节更易发生BRAFV600E突变，无钙化结节发生突变的概率是有钙化结节的4.176倍，贴近前包膜结节发生突变的概率是不贴近前包膜结节的4.844倍（表4）。

表4 二元logistic回归分析结果

3 讨 论

BRAFV600E是最常见的一种与甲状腺癌发生、发展相关的变异基因，对于其引起PTC的机制较普遍的认识是通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路来促进细胞不断增殖进而肿瘤发生［8］。

既往研究［9］发现，PTC患者BRAFV600E突变率为89.6%，特异度100.0%。本研究结果与之相近（突变率86.8%），突变率较高的原因可能与取材及检测技术逐渐成熟相关。

国内外对BRAFV600E突变在PTC侵袭性中的价值存在较多争议。Huang等［10］及Kombak等［11］研究发现，BRAFV600E突变与病理学类型、淋巴结转移、较高的T分期、肿瘤包膜不完整或缺失等侵袭性指标相关。而Czarniecka等［12］对258例PTC（结节最大径＞1 cm）研究显示，BRAFV600E突变状态与任何临床病理预后因素均不相关。Han等［13］也认为BRAFV600E突变不是颈部淋巴结转移的独立预测因子。本组资料显示，BRAFV600E突变与未突变组在各临床病理学特征间差异均无统计学意义，表明单独检测BRAFV600E突变并不能判断PTC的侵袭性。从BRAFV600E突变率（86.78%）与PTC侵袭性指标（颈部淋巴结转移率42.53%及突破包膜发生率14.37%）来看，二者发生率相差较大，前者亦不能预判后者。Mitsutake等［14］研究显示，发生BRAFV600E突变的甲状腺癌结节最大径小于未突变的甲状腺癌结节，且预计这部分发生BRAFV600E突变的甲状腺癌可能有良好的预后，故反向预测（BRAFV600E突变预测PTC弱侵袭性）存在一定可能性。分析各研究得出不同结论的原因，可能与研究方案设计不同、样本选取及所含数量差异、流行病学因素、甲状腺癌不同病理学亚型差异等有关。

对BRAFV600E突变与各超声特征间的关系研究较少，得出的结论也存在明显争议。Park等［15］的研究显示，BRAFV600E突变与各超声特征未见明显相关性。温泉等［16］的研究显示，仅腺体内多发病灶是BRAFV600E基因突变的独立危险因素，而且钙化结节更易出现BRAFV600E突变。本组资料结果显示，只有PTC结节的钙化与位置是BRAFV600E突变的独立危险因素，且无钙化者及贴近前包膜结节更易BRAFV600E突变，与温泉等［16］研究得出的结论不同。分析原因，可能与选择的统计因素及判断标准不同相关。本研究中PTC结节是否多灶以术后病理学检查结果判定为准，显示多灶与BRAFV600E突变无统计学相关性，与既往多个学者［17-18］得出的结论相似，而温泉等［16］学者是以超声结果为标准判断PTC的单灶与多灶，与本研究所选的判断标准有所差异。对于PTC结节钙化对BRAFV600E突变的影响与温泉等［16］学者结论也不一致，本研究PTC钙化结节统计包括了所有钙化（微钙化及粗大钙化），而后者钙化统计仅包含微钙化患者。

既往研究显示，不同部位的PTC其侵袭性不同［19］，有钙化的PTC结节更易发生颈部淋巴结转移［20］。本组资料显示，贴近前包膜及无钙化的PTC结节更易发生BRAFV600E突变，BRAFV600E突变与PTC弱侵袭性相关存在一定可能性，故推测超声显示贴近前包膜及无钙化的PTC结节侵袭性较弱存在一定可能性。

本研究的不足之处：① 本组PTC患者仅进行了单一的BRAFV600E突变检测，未与其他基因联合检测来进一步判断其在侵袭性方面的价值。② 未对PTC结节具体位置与侵袭性指标间的关系进行研究，对具有易发生BRAFV600E突变的超声征象PTC结节的弱侵袭性未能直接证实，今后将对上述两个方面进行研究。

综上所述，单独的BRAFV600E突变与PTC侵袭性特征无明显相关性，故术前超声引导下FNAC标本单独检测BRAFV600E突变并不能预判其侵袭性。超声声像图特征中，无钙化及贴近前包膜的可疑PTC结节更易发生BRAFV600E突变，推测其存在侵袭性较弱的可能。