乳头状甲状腺癌NIS蛋白与糖酵解相关蛋白GLUT1及HK2表达关系的研究

中国医科大学附属第一医院核医学科，辽宁 沈阳 110000

甲状腺癌作为临床常见的一种恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的1%，且女性发病率高于男性[1-2]。与正常甲状腺组织相比，甲状腺癌组织对碘的摄取显著减少，并且钠碘同向转运体（sodium iodide symporter，NIS）蛋白在转录水平和翻译水平也有明显降低，导致癌组织的聚碘能力差从而影响患者术后的疗效[3-4]。与正常组织细胞不同，肿瘤细胞即使在氧气充足的条件下也能使葡萄糖经过一系列酶促反应生成丙酮酸，进而产生乳酸及能量，该过程称为“Warburg效应”[5]。越来越多的研究表明，Warburg效应存在于各种各样的肿瘤细胞中，糖酵解可能是肿瘤细胞供能的主要方式[6-7]。研究证明葡萄糖转运体1（glucose transporters 1，GLUT1）和己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）均参与恶性肿瘤糖酵解过程，可作为肿瘤细胞是否存在糖酵解亢进的标志蛋白[8-9]。实际上，甲状腺肿瘤在PET/CT显像中存在FDG摄取，而相应的131I-全身扫描（131I-whole body scan，131I-WBS）却不显影，这种碘摄取与糖摄取呈相反趋势的现象促使我们探索NIS蛋白与糖酵解相关蛋白GLUT1、HK2之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2017年11月—2018年9月在中国医科大学附属第一医院首次确诊并切除病灶的乳头状甲状腺癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）患者61例。其中女性44例，男性17例，平均年龄（43.84±12.28）岁。上述患者术前均无放化疗史及免疫抑制剂治疗史。

1.2 试剂与仪器

DAB染色剂、抗原修复液EDTA、二抗超敏试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司；兔抗人NIS（1∶50）、GLUT1（1∶500）及HK2（1∶500）蛋白一抗抗体购自英国Abcam公司；组织包埋机、切片机及离心机购自美国Thermo公司；显微镜购自日本Nikon公司。

1.3 方法

采用免疫组织化学技术检测NIS、GLUT1及HK2蛋白的表达情况，并依其表达强度的平均值进行分组。NIS及GLUT1蛋白阳性结果判断标准：目标蛋白定位于甲状腺滤泡上皮细胞基底部质膜、周边质膜或细胞质中，以染色呈淡黄色到棕褐色不等为阳性，无着色为阴性结果。HK2蛋白阳性标准：以细胞质或细胞膜周边出现棕黄色颗粒为阳性，细胞中无着色为阴性。免疫组织化学评分标准根据吴亚等[17]报道，即染色评分标准。① 阳性细胞所占百分比：随机选取5个不同视野，其中阳性细胞所占百分比小于5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。② 阳性染色强度：阴性为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。选择（×400）倍视野，随机选取五个视野进行评分，以阳性细胞所占百分比与阳性染色强度的乘积作为染色评分，将5个视野评分结果取平均值作为最终评分结果。

1.4 分组方法

本研究对PTC中NIS、GLUT1及HK2蛋白进行免疫组织化学评分，样本例数为61例，且NIS、GLUT1及HK2三种蛋白表达强度近似正态分布，均以其平均表达强度区分高低表达。其中NIS蛋白在癌及正常组织中的平均表达强度为（7.19±1.70vs7.90±1.21），以NIS蛋白的平均表达强度作为分组标准，分为高表达组和低表达组，进一步分析NIS蛋白高/低表达组中GLUT1及HK2的表达差异及其相互关系。

1.5 统计学处理

采用SPSS 25.0软件对数据进行统计学分析，计量资料均以±s表示。计量资料采用配对样本t检验和独立样本t检验，且数据经K-S检验服从正态分布；计数资料采用χ2检验。两变量间相关性研究采用Pearson相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PTC中NIS、GLUT1及HK2蛋白在癌及正常组织中的表达

癌组织中NIS蛋白的平均表达强度低于正常组织（7.19±1.70vs7.90±1.21），GLUT1及HK2蛋白的平均表达强度明显高于正常组织（9.00±1.94vs7.39±1.31；7.36±1.68vs6.64±1.43）；NIS、GLUT1及HK2蛋白在癌及正常组织中表达的差异均有统计学意义（t=-3.251、6.54、2.801，P＜0.05，图1，表1）。

2.2 PTC及正常组织中GLUT1和HK2在NIS蛋白高低表达组中的差异

癌组织中HK2在NIS蛋白高低表达组中表达的差异有统计学意义，且呈正相关（t=2.324，P＜0.05；r=0.404，P＜0.05）。GLUT1蛋白在NIS蛋白高低表达组中表达的差异无统计学意义，且无相关性（t=-1.020，P＞0.05；r=0.038，P＞0.05）。正常组织中，HK2蛋白在NIS蛋白高低表达组中表达的差异有统计学意义，但无相关性（t=2.357，P＜0.05；r=0.246，P＞0.05）。GLUT1蛋白在NIS蛋白高/低表达组中表达的差异无统计学意义，且无相关性（t=0.253，P＞0.05；r=-0.177，P＞0.05）。详见表2，图2～3。

2.3 NIS、GLUT1及HK2蛋白表达的临床意义

本研究分别以年龄[平均值（43.84±12.28）岁]、肿瘤大小[平均值（17.80±8.72）mm]、是否伴有淋巴结转移及TNM分期进行分组。结果显示，NIS蛋白在肿瘤大小分组中的表达差异有统计学意义（P＜0.05），HK2和GLUT1蛋白在肿瘤大小分组中的差异无统计学意义（P＞0.05）。NIS、GLUT1及HK2表达情况在年龄、是否伴有淋巴结转移及TNM分期差异无统计学意义（表3）。

典型患者影像图及免疫组织化学图见图4。

图1 NIS、GLUT1及HK2蛋白在正常组织及癌组织中的表达

表1 NIS、GLUT1及HK2蛋白在癌组织及正常组织中的表达

表2 PTC及正常组织中GLUT1和HK2在NIS蛋白高低表达组中的表达

图2 PTC癌组织中GLUT1及HK2在NIS蛋白高低表达组中的表达情况

图3 PTC正常组织中GLUT1及HK2在NIS蛋白高低表达组中的表达情况

表3 癌组织中NIS、GLUT1及HK2蛋白高表达与临床病理学参数的关系

图4 典型患者（患者，男性，57岁，诊断为PTC）影像图及免疫组织化学图

3 讨 论

3.1 NIS在PTC中的意义

近些年甲状腺癌逐渐成为常见的恶性肿瘤之一，其发病率与性别、年龄及分布地区有关，并且逐渐成为发病率增速最快的癌症[11-12]。NIS作为转运钠离子和碘离子的糖化膜蛋白，主要表达于甲状腺滤泡上皮细胞基底膜外侧，并且其表达水平与甲状腺癌的发生、发展有着密切的关系。本研究中，NIS蛋白在癌组织与正常组织中的表达差异有统计学意义（P＜0.05），同时本研究中约有31%的甲状腺癌组织的NIS表达水平与正常组织相当，甚至略超过正常组织，而这种个别过表达的现象与Dohán等[13]研究结果相近。Saito等[14]研究同样提示NIS蛋白在甲状腺癌与正常组织中表达存在差异，分化良好的甲状腺癌组织中的NIS表达水平高于分化较差的组织，同时存在癌组织中NIS蛋白过表达的现象。

3.2 甲状腺癌中的糖酵解过程

糖酵解作为肿瘤细胞常见的能量代谢方式同样存在于甲状腺癌中，由于产能效率不及有氧氧化，导致恶性肿瘤细胞必须摄取大量的葡萄糖以满足其增殖分化之需要。细胞摄取葡萄糖主要依赖于细胞膜上的GlUT1及HK2等蛋白。有研究显示，GLUT1在甲状腺癌中呈高表达[15]，同时GLUT1表达与甲状腺癌的分化程度密切相关，即GLUT1蛋白在甲状腺低分化癌或未分化癌中的表达最高，其表达越高表明甲状腺癌的糖代谢能力越强[16]。本研究结果显示，GLUT1及HK2蛋白表达在甲状腺癌及正常组织中表达的差异有统计学意义（P＜0.05）。在癌组织中GLUT1及HK2蛋白表达强度普遍高于正常组织，这种现象与吴亚等[17]研究结果相符。虽然本研究并未发现GLUT1及HK2蛋白表达在年龄、肿瘤大小、是否伴有淋巴结转移及TNM分期分组中存在差异，但Matsuzu等[18]研究结果显示，GLUT1蛋白在肿瘤分期方面的差异有统计学意义，提示GLUT1蛋白可作为判断肿瘤分期的指标。

3.3 NIS蛋白与GLUT1、HK2蛋白的关系

NIS、GLUT1及HK2蛋白不仅是甲状腺癌组织碘代谢与糖代谢的基础，也是临床工作中131I-WBS及PET/CT显像的基础。本研究结果提示，癌组织中HK2蛋白与NIS蛋白的表达呈正相关，而GLUT1蛋白与NIS蛋白无明显相关性。同时NIS蛋白在肿瘤大小分组中表达存在差异，而GLUT1及HK2蛋白无明显差异。有研究认为GLUT1在有淋巴结转移组中的表达高于无淋巴结转移组，但差异无统计学意义[18]，与本实验研究结果相同。Jung等[19]认为，PTC中存在的碘代谢和糖酵解之间的关系可以为判断甲状腺肿瘤分化情况提供帮助。本研究中未见NIS、GLUT1及HK2蛋白表达在肿瘤分期分组中存在差异，可能与本研究纳入的甲状腺癌类型及样本数量有关。

3.4 PTC 131I-WBS与PET/CT显像

临床工作中，131I-WBS作为甲状腺癌术后的随访方式，但由于PTC及其转移灶常发生失分化，使其摄碘功能降低或丧失，导致131I-WBS对病灶检出率较低[20-21]。临床上有10%～15%的PTC在转移过程中发生失分化引起细胞摄碘功能降低或消失，造成131I-WBS探测PTC及转移灶时呈假阴性[22-23]。Feine等[24]的研究首先发现“触发现象”（flip-flop），认为甲状腺癌及转移灶中存在131I摄取与FDG摄取之间的相反关系，这为甲状腺癌131I-WBS联合PET/CT显像提供了方向。131I-WBS和18F-FDG PET/CT在分化型甲状腺癌（differentiated thyroid carcinoma，DTC）术后患者转移灶探测及决定下一步的治疗方案方面具有良好的互补性，特别是18F-FDG PET/CT在Tg（+）、131I-WBS（-）患者转移灶检出上更具有优势，其显像的灵敏度为79.3%[25-26]。本研究从蛋白层面上分析了PTC中碘代谢关键蛋白NIS与糖代谢相关蛋白GLUT1及HK2的关系，其在癌组织中的表达关系为实际临床工作中PTC131I-WBS存在假阴性，而相应PET/CT显像存在18F-FDG摄取这种反转现象提供了解释。本研究发现个别患者131I-WBS和PET/CT显像同时存在摄取（图4），可能与本实验选取的甲状腺癌类型较单一有关；同时由于PTC为分化型甲状腺癌且分化较好，癌组织NIS蛋白并未完全失去摄碘功能，而相应组织同时存在糖酵解过程。131I-WBS和PET/CT显像的反转现象还需后续实验验证。