NLRP3—Caspase-1—IL-1β通路在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤中作用研究①

王显鹤,张 洋,杨玲霞,王 娇,梅 梅,聂 影,李 蕊

(1.佳木斯大学,黑龙江 佳木斯 154007;2.齐齐哈尔市第一医院,黑龙江 齐齐哈尔 161005;3.深圳市龙岗区妇幼保健院,广东 深圳 518172)

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是指围产期窒息引起的部分或完全缺氧、脑血流减少或暂停而导致胎儿或新生儿脑损伤。研究表明,炎症在神经系统疾病的发生及发展过程中具有重要作用[1]。另外新生儿脑缺氧缺血后神经炎症引发先天和适应性免疫应答,而作为先天性免疫的重要组成成分炎症小体与脑损伤的发生、发展具有相关性,其中NLRP3炎症小体具有核心作用[1]。本文主要研究NLRP3炎症小体通路在新生大鼠HIE发生发展过程中的作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

健康清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠120只,生后7d,2:1雌雄比例合笼(长春市亿斯实验动物技术有限公司);兔源NLRP3抗体(Abcam生物工程公司)、鼠源Caspase-1抗体(SANTA CRUZ生物工程公司)、鼠源IL-1β抗体(SANTA CRUZ生物工程公司)。

1.2 模型制作

参照改良Rice-Vannuncci法制备HIE模型。恒温的37℃缺氧箱,将缺氧后的新生鼠放回母鼠身边常规喂养。缺血缺氧后出现自发前爪伸直障碍、站立不稳、翻身困难、夹尾反应、四肢抖动或抽搐者纳入实验。

1.3 方法

将7d龄SD大鼠,随机分组:空白对照组(Control组)、假手术组(Sham组)及缺氧缺血性脑损伤组(HIE组)各40只。每组实验开始6h、48h、72h和7d时间点检测。HIE组:手术暴露右侧颈总动脉(RCCA),永久结扎RCCA近、远心端并剪断结扎线中间血管后缺氧处理。Sham组:手术仅暴露分离的RCCA,不做结扎缺血,不做缺氧处理。Control组:不做任何处置。

1.4 统计学方法

2 结果

新生大鼠HIE组与Sham组及Control组比较,HIE组不同时间点的NLRP3、Caspase-1和IL-1β水平均明显增加,差异有统计学意义(P<0.01),且NLRP3、Caspase-1和IL-1β在HIE组 6 h均可见水平增高,随着时间延长表达逐渐增加,7 d表达最明显,差异有统计学意义(P<0.01)。

2.1 脑组织中NLRP3蛋白表达测定

见表1。

表1 各组SD新生大鼠脑组织不同时间点NLRP3的表达

2.2 脑组织Caspase-1蛋白表达测定

见表2。

表2 各组SD新生大鼠脑组织不同时间点Caspase-1的表达

2.3 脑组织中IL-1β蛋白表达测定

见表3。

表3 各组SD新生大鼠脑组织不同时间点IL-1β的表达

3 讨论

新生儿缺氧缺血性脑损伤是新生儿脑损伤最常见的形式,是由围产期窒息所引起,可导致全世界23%～25%新生儿死亡。HIE的病理生理过程是因血流量减少和脑组织缺氧所致。缺氧缺血导致新生大脑中的小胶质细胞活化[2]。有研究表明,缺氧缺血会诱发周围免疫系统和脑实质的炎症反应,在介导神经元死亡中起关键作用[3]。神经元死亡可直接导致神经胶质细胞活化,进而引起炎性介质(促炎性细胞因子和趋化因子)大量释放造成神经元凋亡。此外,活化的神经胶质细胞释放基质金属蛋白酶(MMP)和炎症介质导致外周免疫细胞的募集和活化,从而释放神经毒性物质进一步增强神经元死亡。

相关研究证实,HIE的大鼠造模成功后2h可检测到小胶质细胞被激活[4]。小胶质细胞是由早期神经元死亡激活的,在触发神经炎症中起核心作用。HIE后以M1型小胶质细胞激活为特征,进而导致继发性神经元死亡和脑损伤。引起M1激活的最有效机制之一为IL-1β和IL-18的释放。Caspase-1对这两种促炎因子的成熟和分泌至关重要,在HIE后在小胶质细胞内表达。Liu等研究表明Caspase-1缺乏会明显减轻新生小鼠缺氧缺血后脑损伤[5]。IL-1受体拮抗剂和IL-1β的使用分别对新生儿脑损伤具有神经保护作用和神经毒性作用[6]。而NLRP3炎症小体是活化Caspase-1,控制IL-1β释放的上游信号因子。因此本实验建立新生HIE Rice-Vannucci模型[7]进一步探究NLRP3炎症小体通路在新生大鼠缺氧缺血性脑病中的作用机制。

Tschopp团队首次发现并揭示了炎症小体与组织损伤、先天免疫过程和Caspase-1之间的关键联系[8]。炎症小体复合物具有三个主要成分:胞质模式识别受体、Caspase-1和促进两者之间相互作用的衔接蛋白。NLRP3炎症小体激活需要两个信号过程。信号1:TLR配体脂多糖(LPS)可通过诱导IL-1β的转录和翻译,同时激活NLRP3炎症小体。信号2:ATP等可触发炎症小体复合物的形成,引起Caspase-1的活化以及IL-1β、IL-18的裂解和释放。离子紊乱、线粒体功能障碍和ROS产生等各种刺激导致NLRP3活化的事实,表明NLRP3炎症小体可充当细胞损伤或应激的传感器。CNS对IL-1β、IL-18信号特别敏感,Caspase-1的活化以及随后的细胞因子释放加重了免疫病理性疾病,导致神经元死亡[9,10]。本实验结果显示:不同组别NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达,Sham组与Control组各时间点Caspase-1表达比较差异无显著意义(P>0.05);HIE组与Sham组及Control组对比Caspase-1蛋白水平明显增加(P<0.01)。不同时间点NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达,Sham组6h、48h、72h及7d各时间点比较,差异无显著意义(P>0.05);Control组6h、48h、72h及7d各时间点比较,差异无显著意义(P>0.05);HIE 48h、72h组与HIE 6h组比较,差异有统计学意义(P<0.01),HIE 72h组与HIE 48h组比较差异无显著性意义(P>0.05),HIE 7d组与其余各时间点HIE组相比差异均有显著意义(P<0.01)。HIE组NLRP3、Caspase-1、IL-1β水平明显高于对照组,HIE发病早期6h后NLRP3、Caspase-1、IL-1β开始增加,随时间变化表达逐渐增加,HIE后7天达到高峰。结果表明NLRP3、Caspase-1、IL-1β参与了新生SD大鼠缺氧缺血后原发与继发性脑损伤,表达水平越高,脑损伤程度越重,但其具体机制还需要进一步研究。

综上所述,本实验证实NLRP3炎症小体及下游因子Caspase-1、IL-1β参与新生大鼠HIE的发生发展过程,其表达与脑损伤程度相关,为靶向治疗新生儿HIE提供了实验基础。但其上游激活途径、是否有其他炎症小体参与、不同时间段及脑组织表达部位是否存在差异、炎症小体抑制剂是否能减轻HIE等仍需进一步研究。