COL3A1在头颈鳞癌中的表达研究①

何 超，张 雪， 刘 爽

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

头颈鳞癌包括颈部肿瘤、耳鼻喉科肿瘤以及口腔颌面部肿瘤三大部分，发病率较高的为口腔鳞癌、鼻咽癌、喉癌。超过90%的头颈部肿瘤为鳞状细胞癌。最近10年全球头颈部鳞状细胞癌的发病率明显上升，全球每年约有645，000例新发生的头颈部癌病例[1，2]。在大多数国家，头颈部肿瘤男性多于女性，且年龄≥50岁者多见。头颈鳞癌发病隐匿，且容易发生淋巴结转移，手术后复发风险高，5年生存率不足50%[3]。TCGA数据库是由美国国家癌症研究所与美国国家人类基因组研究所合作建立的癌症研究项目，汇总了癌症相关的各种组学数据，是目前世界最大的癌症研究参考数据库。TCGA数据库免费提供33种癌症的DNA、RNA、miRNA测序结果以及SNP、甲基化测序等多维度数据，通过这些信息帮助各国研究者分析癌症特异性表达的基因[4]。我们课题组使用GEPIA在线软件对TCGA数据库分析头颈鳞癌特异性基因，并在细胞水平进行验证，为头颈鳞癌特异性生物标志物的寻找提供实验基础。

1 资料与方法

1.1 数据获取及差异分析

通过GEPIA在线软件进行泛癌分析COL3A1在31种癌症中表达差异，进而分析COL3A1在头颈鳞癌人群与正常人群中表达水平，以及在头颈鳞癌不同阶段表达情况。

1.2 实验材料

正常口腔成纤维细胞株hMOF,口腔鳞状细胞癌细胞株KB与CAL-27,由口腔医院关键教授惠赠。DMEM培养基，胎牛血清，TRIZOL试剂(购自碧云天生物公司)，反转录试剂MightyScript 第一链 cDNA 合成Master Mix，荧光定量SYBR-qPCR Kit扩增试剂盒(购自上海生工生物公司)。

1.3 细胞株中COL3A1表达水平检测

1.3.1 细胞培养

37℃,5%CO2条件下培养细胞，收集指数生长期细胞，常规0.25%胰蛋白酶消化，计数，PBS洗涤离心，Trizol法提取总RNA。

1.3.2 实时荧光定量PCR检测COL3A1

使用生工RNA反转录试剂盒合成cDNA。反应温度为：25℃5min；42℃30min；85℃5min。按生工荧光定量PCR试剂盒(染料法)说明书推荐进行。COL3A1引物序列为：上游引物：5`-TCAGGCCAGTGGAAATGRAAAGA -3`,下游引物：5`-CACAGCCTTGCGTGTTCGATA -3`； TGF-β3引物序列为：上游引物：5`-CTCTACATTGACTTCCGACA -3`，下游引物：5`-GCAGATGCTTCAGGGTTC -3`。采用β-actin作为内参，引物序列为：上游引物：5`-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC -3`,下游引物：5-`ATGGAGCCACCGATCCACA -3`。反应体系：2Xmirna qPCR master mix 10μL；上下游引物各0.5μL；cDNA 2μL；ROX Reference Dye(H)1μL；RNase-free water 6μL；应用7300 real time PCR进行检测。反应条件为：95℃150s；(95℃15s +60℃30s)进行40个循环；溶解曲线以7300 real time PCR仪推荐的程序自动设定。每份样本均在同等条件下进行COL3A1的检测，每个样本进行3次重复。浓度相对水平进行对数( 2^-△△CT) 处理后，比较COL3A1基因的起始模板量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 COL3A1在泛癌中的表达水平

对于头颈鳞癌，TCGA数据库包含519例肿瘤患者与44名正常对照者的总RNA表达信息。使用GEPIA在线分析，得到COL3A1,COL5A1，COL5A2,COL1A1,COL1A2，ADAM12以及COL12A1等差异表达基因，其中COL3A1差异最显著，以此为切入点，进行泛癌分析，发现在31种癌症中，COL3A1在乳腺浸润癌BRCA，食管癌ESCA,恶性胶质瘤GBM,头颈鳞癌HNSC,胰腺癌PAAD,胸腺瘤THYM等13种癌症中高表达并有统计学意义。见图1。

图1 COL3A1在不同癌症与正常对照组织中表达

2.2 COL3A1在头颈鳞癌中的表达水平

TCGA数据库收集头颈鳞癌患者519例，正常对照44例，通过RT-qPCR检测mRNA水平，箱式图及TPM图可以明确COL3A1在头颈鳞癌组织中高表达并且有统计学意义。见图2。

图2 COL3A1在头颈鳞癌与正常对照组织中表达

在头颈鳞癌发展的不同阶段，可以看到COL3A1的表达水平的中位数变化不明显，但变化范围增加。见图3。

图3 COL3A1在头颈鳞癌不同时期表达

2.3 COL3A1在头颈鳞癌细胞株中的表达水平

从正常口腔成纤维细胞株hMOF与头颈鳞癌细胞株KB，CAL中提取mRNA并反转录合成cDNA，通过染料法检测COL3A1表达水平，RT-qPCR结果显示，COL3A1在肿瘤细胞株中高表达，并且差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 COL3A1及TGF-β1在头颈鳞癌细胞株中表达

3 讨论

头颈鳞癌包含种类较多，发病情况复杂，口腔鳞癌是其中的代表性鳞癌，虽然其都属于鳞状细胞癌，但由于发病位置不同，发病机制也各不相同。目前头颈部的鳞状细胞癌主要以手术治疗为主，虽然随着医疗水平的不断发展，治疗手段不断完善，但总体预后还是不容乐观。肿瘤的微环境与肿瘤的发展迁移密切相关，细胞外基质中的成分与肿瘤的发生发展关系密切，在细胞基质中胶原蛋白超家族是主要组成部分，细胞外基质中胶原蛋白主要包括I型、II型、III型、V型胶原蛋白。COL3A1基因编码的III型胶原蛋白，广泛存在于细胞外基质，与细胞的增殖、分化与迁移/侵袭有密切关系，但在肿瘤的的发展迁移中的作用尚未有定论。有文献报道，COL3A1的高表达形成的胶原蛋白具有一定屏障作用，可以抑制肿瘤细胞的迁移，也有文献报道，COL3A1的高表达可以促进肿瘤的侵袭与迁移[5,6]。本文通过GEPIA在线分析发现在多种癌症中COL3A1呈现高表达趋势，并且在细胞水平验证，在恶性程度较高的肿瘤细胞株中COL3A1表达明显增加，与数据库预测结果一致。本文同时也检测了肿瘤相关的转化生长因子(transforming growth factor-β, TGF-β)家族中TGF-β3的表达水平。TGF-β3参与器官纤维化、创面愈合以及瘢痕形成等生理病理活动并发挥促细胞增殖，迁移及促进胶原蛋白合成及调控纤维化等作用。已经有文献报道，TGF-β通过Smad2/3信号通路来实现对胶原合成调控，可以上调COL3A1基因的表达，促进III型胶原蛋白产生，在本实验中也发现TGF-β3的表达与COL3A1表达趋势相近，说明可能参与共同信号通路调控的生物反应。

综上所述，COL3A1的高表达在肿瘤细胞株中具有潜在的诊断意义，但由于头颈鳞癌的种类复杂，发病位置不同，涉及的组织则不同，转移机制也有差异，本实验没有经过大量临床样本验证，其作为生物标志物的临床实用性有待进一步研究。