miR-509-3p与Rab11a在喉鳞状细胞癌中的表达及其意义①

金秀琳，詹俊杰，范宗宪

(佳木斯大学附属第一院耳鼻喉科，黑龙江 佳木斯 154003)

喉癌是耳鼻咽喉头颈外科多发病之一，其分子发病机制的研究目前还有待深入，喉癌患者的早期诊断对精准特异化治疗至关重要，因此急需探明喉癌基因源性发病机制。微小RNA (microRNA, miRNA)是由小于30个核苷酸序列组成的不直接翻译蛋白产物的小RNA，参与细胞新陈代谢、复制增殖及自噬凋亡等重要生命过程[1,2]。经研究发现miR-509-3p为调节肿瘤发生发展的重要因子。本研究运用RT-qPCR检测miR-509-3p和预测靶标基因Rab11a在喉癌及癌旁组织中的表达量；再行miR-509-3p mimics转染Hep-2细胞，检测Rab11a的表达量，分析miR-509-3p和Rab11a的相关性。为寻求喉癌的分子发病机制提供一定的参考依据。通过对miR-509-3p在喉癌中的重要作用，将为今后喉癌miRNAs的诊断治疗提供新视点。

1 材料与方法

选取2019-01～2019-10于佳木斯大学附属第一医院耳鼻喉科治疗的术中新鲜标本15例，均为初次患病，术前未经放疗及化疗且病理报告为喉部鳞状细胞癌。癌标本切取肿瘤主体，避开坏死区域；癌旁正常标本取距肿瘤安全缘0.5cm以上的组织。标本离体清洁后，半小时内置于无RNA酶的专用冻存管液氮罐中速冻。15例喉癌患者中，男12例，女3例，年龄52～76岁，平均62.4岁。其中TNM分期依照UICC2002第6版喉癌分期标准[3]，其中II期3例，III期9例，Ⅳ型3例。组织学类型依照1990年WHO喉癌分类标准[4]分类，其中高分化型5例，中分化型8例，低分化型2例。

1.1 试剂与仪器

Trizol RNA提取液(天根)，PerfectStart Green qPCR SuperMix(AQ601-04全式金)，oligdT(擎科)，RNase inhibitor(E00381 Thermo)，RevertAid Reverse Transcriptase(EP0441 Thermo)，实时荧光定量PCR仪(Q1 ABI)，超微量核酸分析仪(Nano-200 杭州奥盛仪器有限公司)，冷冻离心机(H2100R 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)等。

1.2 提取总RNA

将TRizoI抽提液与组织标本或细胞混匀，加氯仿震荡，离心，上清液加异丙醇后静置数小时，离心取沉淀物，待部分溶解后加DEPC水，完全溶解后于超微量核酸分析仪下测提取RNA的纯度及浓度(A260/280比值在1.8～2.1时，提示满意)，琼脂凝胶电泳测总RNA的完整度情况。检测合格后将总RNA置于-80 ℃冰箱冻存。见表1。

表1 转染miR-509-3p-mimics后总RNA纯度及浓度检测

1.3 实时荧光定量逆转录PCR(RT-qPCR)方法

取总RNA为初始模板，在特异引物和逆转录酶的作用下，合成与待测模板互补的DNA，产物为模板RNA-cDNA双链结构，该结构中模板RNA被RNA酶H降解，仅留新合成的cDNA作为PCR放应的初始模板进行扩增。通过PCR放应体系中荧光基团发光程度计算2-△△Ct值，评估初始RNA模板的相对表达量。

引物设计如下： miR-509-3p-R：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATT-CAGTTGAGCTACCC；miR-509-3p-F：GCCGAGTGATTGGTACGTCT；has-Rab11a-175-F：AGAAGCATCCAGGTTGATGG；has-Rab11a-175-R：GTTCTTTCAGCCATCGCTCT。GAPDH-127F(H)：CCAGGTGGTCTCCTCTGA；GAPDH-127R(H)：GCTGTAGCCAAATCGTTGT。

1.4 细胞培养、细胞转染

将Hep-2细胞快速融化，离心后置于10%胎牛血清的完全培养基，吹打混匀后转移至培养瓶中37℃ 5%CO2孵箱中进行培养。细胞呈对数生长期，平铺细胞几近接触时进行传代。

转染：将培养瓶中贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，完全培养基终止消化，按照Hep-2细胞密度为5×104个/孔接种到24孔板中，平铺细胞后培养18～24h，当细胞长至60%～80%后，给予转染。RT-qPCR检测基因表达同前。

1.5 统计学方法

采用IBM SPSS statistics 23.0统计软件，应用独立样本t检验用于两组以上数据之间的比较，数据均以平均值±标准差表示，皮尔逊相关性分析 miR-509-3p与Rab11a相对表达量之间的相关性。P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-qPCR检测15例喉癌组织中miR-509-3p平均表达量低于癌旁组织(P<0.05)，见图1A；Rab11a平均表达量高于癌旁组织(P<0.05)，见图1B；皮尔逊相关分析呈负相关(r<0)。

A B

2.2 miR-509-3p mimic转染喉癌Hep-2细胞株后预测目的基因Rab11a表达水平，统计结果揭示转染miR-509-3p mimic组预测靶基因Rab11a表达水平较NC转染组和空白组下调(P<0.05)。见图2。Rablla表达图 RT-9PCT扩增曲线及熔解曲线，见图3。

图2 转染miR-509-3p-mimics后Rab11a表达量

A B

3 讨论

喉癌患病率排名仅次于鼻咽癌，大多数为鳞状细胞癌，仅5%左右为其他类型细胞癌，占全身恶性肿瘤的3%左右。据统计，在中国每十万人就有一人患有喉癌，东北、华北的发病率较高。为减少喉癌的患病率及有效的靶向治疗，急需寻求喉癌发病的分子机制。miRNA能够特异性结合在目标信使RNA ( mRNA)的3' 非翻译区，当碱基配对互补结合时，直接将目标mRNA切割降解；如碱基对只部分配对结合，则制止mRNA蛋白质翻译表达[5]。新研究发现，miRNA还可结合到目的mRNA 5'非翻译区[6]和基因表达区[7]，从而对蛋白翻译过程进行修饰。

miRNA-509-3p已成为肿瘤发生发展的重要调节因子。miRNA-509-3p在胃癌组织[8]、肾癌组织[9]及卵巢上皮癌组织[10,11]中表达均下调。而且过表达miRNA-509-3p抑制胃癌细胞的存活能力，提高远期生存率，还可以诱导了肾癌细胞凋亡作用。同时提高卵巢癌上皮细胞对顺铂的敏感性。

Rab11a在膜受体介导的胞吞大分子物质中发挥着重要的作用。高表达Rab11a后：通过TBC[12]结构域抑制细胞自噬行为；抑制非小细胞肺癌的细胞凋亡，促进淋巴转移及预后不良；还可提高胰腺癌细胞的增殖能力，通过磷酸化GSK3β激活Wnt信号通路[13]促进细胞周期蛋白D1、E的表达而实现[14]。

为了明确miRNA-509-3p和 Rab11a在喉癌中表达量及相关性，探索其可能致病机理。本课题分为2部分进行研究：首先运用RT-qPCR检测miR-509-3p和Rab11a在15例喉癌及癌旁组织中的表达量，发现miR-509-3p平均表达量低于癌旁组织，Rab11a平均表达量高于癌旁组织(P<0.05)；皮尔逊相关分析呈负相关(r<0)。再行miR-509-3p mimics转染Hep-2细胞，经转染miR-509-3p mimic组Rab11a表达水平较NC转染组和空白组下调(P<0.05)。分析Rab11a的致癌原因可能通过磷酸化GSK3β激活Wnt信号通路促进细胞周期蛋白D1、E的表达，提高喉癌细胞的增殖能力；增强喉癌细胞对大分子物质的摄取，为肿瘤细胞的生长提供营养支持；再之通过TBC结构域抑制癌细胞自噬行为，为喉癌细胞的生存提供完整的基本结构和保障。本研究证实miR-509-3p至少可通过负向调控Rab11a的表达而发挥其抑癌作用，为进一步证实Rab11a是miR-509-3p的靶基因奠定了实验基础。如确定Rab11a是miR-509-3p的靶基因还需做双荧光素酶报告质粒实验；对于miR-509-3p和Rab11a对喉癌细胞迁移能力的影响及是否抑制喉癌细胞凋亡等方面还有待继续研究。