电压依赖性钾通道在Aβ1-40诱导的海马神经干细胞凋亡中的作用①

王国辉，陆晓红，白 禹，杨晓玉，阴育红，金 鑫

(1. 佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003；2. 佳木斯市中心医院，黑龙江 佳木斯 154002)

电压依赖性钾通道在Aβ1-40诱导的海马神经干细胞凋亡中的作用①

王国辉1，陆晓红1，白 禹1，杨晓玉1，阴育红2，金 鑫2

(1. 佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003；2. 佳木斯市中心医院，黑龙江 佳木斯 154002)

目的：探讨在Aβ1-40诱导的海马神经干细胞凋亡过程中电压依赖性钾通道的作用。方法：应用膜片钳技术观察Aβ1-40(5μM)慢性孵育12h、24h和48h对海马神经干细胞延迟整流钾电流(IK)和瞬时外向钾电流(IA)的影响；在Aβ1-40(5μM)孵育前30min加入钾通道阻断剂TEA(5mM)共同孵育12h、24h和48h，应用Hoehest33342染色和MTT法检测TEA与Aβ1-40联合作用后对神经干细胞凋亡的影响。结果：在不同时间点Aβ1-40均可增加IK，12h最显著(P<0.01)，但IA并未发生明显改变；Aβ1-40引起的IK增加与TEA密切相关，表现为给予TEA后Aβ1-40诱导的神经干细胞死亡明显减轻。结论：Aβ1-40激活延迟整流钾通道后促进海马神经干细胞凋亡。

Aβ1-40；钾通道；凋亡

阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)又叫老年性痴呆，是一种严重的退行性脑病，其主要特征表现为β-淀粉样多肽(Aβ)的大量沉积和神经元的大量丢失[1,2]。其中，Aβ聚集被认为是AD病理机制的核心问题。许多研究均已证实，由Aβ诱导的神经细胞损伤主要为细胞凋亡，如自由基的产生、钙离子平衡紊乱、微管结合能力丧失等。此外，近年有大量研究表明，许多凋亡刺激因素可引起细胞内钾离子平衡失调，表现为细胞外钾离子浓度过度升高[3～5]，从而促进凋亡的发生。本实验以Aβ1-40和TEA为施加因素，观察电压依赖性钾通道在Aβ1-40诱导的神经干细胞凋亡中的作用，为探讨AD的发病机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(<72h)，雌雄均可，购于佳木斯大学实验动物中心。

1.2 主要实验药品

Aβ1-40购于Biosouxee公司，MTT、Hoechst

-33342、TEA购于Sigma公司。

1.3 实验方法1.3.1 全细胞膜片钳技术

在倒置显微镜下选择边缘整齐、胞内无明显颗粒的细胞进行封接，通过负压抽吸形成高阻封接后再Zap破膜形成全细胞记录。采用Multiclamp700B型膜片钳放大器记录电流，经滤波及数字化处理后，应用pclampsoftwaysystem10.2软件进行数据分析。

1.3.2MTT法

在神经干细胞中加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)，置37℃培养4h，吸去培养液后加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，低速振荡10min，酶标仪OD570nm处检测各孔吸光值。

1.3.3Hoechst33342法

在细胞中加入4%多聚甲醛，与培养液以1：3混合，固定细胞10min。去除固定液，在各组细胞中加入Hoechst33342，37℃孵育15min。吸除染色液并洗涤后，直接在荧光显微镜下观察结果。

2 实验结果

2.1Aβ1-40慢性孵育对海马神经干细胞IK和IA的影响

Aβ1-40(5μM)慢性孵育12h、24h和48h后，应用全细胞膜片钳技术观察Aβ1-40对海马神经干细胞IK和IA的影响。结果显示，Aβ1-40呈时间依赖性的增加IK，即随着时间的增加，IK逐渐增加，12h达峰值(n=7，P<0.01)，见图1。但IA并未发生明显改变(n=7，P>0.05)，见图2。

图1 Aβ1-40对海马神经干细胞IK的影响

图2 Aβ1-40对海马神经干细胞IA的影响

2.2TEA与Aβ1-40联合作用对海马神经干细胞凋亡的影响

在Aβ1-40(5μM)孵育前30min加入TEA(5mM)，与Aβ1-40共同孵育12h、24h和48h，应用MTT法观察其对海马神经干细胞存活率的影响。结果显示，TEA可明显减轻Aβ1-40诱导的神经干细胞死亡，使细胞存活率明显升高(P<0.01),见图3。

图3 TEA与Aβ1-40联合作用对海马神经干细胞存活率的影响

(与对照组相比#P<0.01；与Aβ1-40组相比*P<0.01)

在Aβ1-40(5μM)孵育前30min加入TEA(5mM)，与Aβ1-40共同孵育48h，应用Hoehest33342染色观察其对海马神经干细胞凋亡发生率的影响。结果显示，TEA可明显降低Aβ1-40所引起的细胞凋亡发生率，由(19.3±0.6)%降至(10.1±0.4)%(P<0.01)。

3 讨论

AD是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，主要病理特征为新皮层、海马出现高度老年斑、神经纤维缠结和大量神经元的丢失等[6,7]。Aβ是构成老年斑的重要成分，由39～43个氨基酸组成。有关文献报导，Aβ的毒性作用可通过扰乱细胞内钾离子的平衡而发挥作用[8]，然而，钾离子功能紊乱所致的神经毒性与AD的发病机制之间所存在的关系还不十分清晰。因此，有必要做进一步研究，为明确钾通道的病理生理作用及Aβ的毒性作用机制提供依

据。本实验以Aβ1-40和TEA为施加因素，观察了TEA在Aβ1-40所诱导的海马神经干细胞凋亡中的作用，结果显示，Aβ1-40可明显增加延迟整流钾通道的活性，使得IK明显增加，但IA并未发生明显改变；同时，Aβ1-40引起的IK增加与TEA密切相关，表现为给予TEA后Aβ1-40诱导的神经干细胞死亡明显减轻。这些结果都表明，延迟整流钾通道的激活参与了Aβ1-40诱导的海马神经干细胞凋亡过程，即，Aβ1-40首先激活延迟整流钾通道，引起K+的大量外流，进而引起海马神经干细胞的凋亡。然而，在Aβ1-40诱导的细胞凋亡过程中有哪些信号转导途径介导尚不十分清楚，因此，在今后的实验中可进一步研究，以更加明确Aβ1-40诱导的细胞凋亡过程的机制。

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Effect of voltage-dependent potassium channels on the hippocampal neural stem cells apoptosis inducing by the Aβ1-40

WANGGuo-hui1,LUXiao-hong1,BAIYu1,YANGXiao-yu1,YINYu-hong2,JINXin2

(1.The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003，China;2.Jiamusi Central Hospital, Jiamusi 154002,China)

Objective:To investigate the effect of voltage-dependent potassium channels on the hippocampal neural stem cells apoptosis inducing by the Aβ1-40.Methods:Hippocampal neural stem cells were chronic incubated at different time point with Aβ1-40to observe the change of delayed rectifier potassium current and transient outward potassium current by the patch clamp technique. And 30 minutes before incubation, the potassium channel blocker (TEA) was added together with Aβ1-40incubated at different time point and to observe the survival and apoptosis rate of the neural stem cells by the MTT method and Hoehest33342 staining.Results:The Aβ1-40can gradually increase the IK with increasing time and reaching the spike at the 12 hour, while the IA has not obvious change. The TEA can obviously reduce the neural stem cells death by the Aβ1-40induced.Conclusion:The delayed rectifier potassium channels participate in the apoptosis process of hippocampal neural stem cells by the Aβ1-40induced.

Aβ1-40; potassium channel; apoptosis

黑龙江省教育厅科学技术研究项目资助项目，编号：12521569。

王国辉(1971～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，副主任医师。

Q

A

1008-0104(2017)02-0011-02

2016-10-10)