北京市门头沟区2018-2020年急性胃肠炎患者诺如病毒基因型分析

刘海涛，曹殿起，张博文，吕秋艳，苏 健

(门头沟疾病预防控制中心，北京 102300)

急性胃肠炎是全球范围内的常见病，临床主要表现为大便次数增多且性状改变，可伴有发热、呕吐、腹痛，重者继发水电解质紊乱、酸碱失衡和全身中毒症状。在我国，每年患急性胃肠炎人数约8.36亿，急性胃肠炎发病率位居所有传染性疾病首位；在世界范围内，病毒是造成急性腹泻发生的主要原因，其中，诺如病毒( Norovirus, NoV)已成为最常见的肠道感染病原体之一，继轮状病毒(Rotavirus, RV) 之后，NoV已成为可引起人类病毒性急性胃肠炎的主要病原体[1]。在全球，每年因诺如病毒感染导致约6.99亿人感染和超过20万人死亡[2-3]。

自2014年冬季以来，我国诺如病毒暴发疫情大幅增加。为了解北京市门头沟区急性胃肠炎患者诺如病毒流行特征，探讨溯源关系，现对2018-2021年急性胃肠炎患者诺如病毒基因特征进行分析，为诺如病毒感染的科学防控提供依据。

1 材料与方法

1.1主要仪器与试剂 Q5型实时荧光定量PCR仪(美国Theme公司)，kingfisher核酸提取仪(美国Theme公司)。诺如病毒GI群检测试剂盒、诺如病毒GⅡ群检测试剂盒(北京卓诚惠生有限公司)，核酸提取试剂盒(上海医脉赛科技有限公司)。

1.2样本来源 收集2018年1月-2020年12月北京市门头沟区监测哨点医院(门头沟区区医院、京煤集团总医院)的急性胃肠炎患者粪便标本。采集标准: 急性胃肠炎病例定义是24小时内呕吐1次，或者腹泻达到3次。急性胃肠炎粪便标本放于-80 ℃保存备用。

1.3病毒核酸提取 制备10%的便悬液，取黄豆大小的粪便，用300 μl的PBS稀释，振荡混匀后1 500 r/min，离心10 min；离心结束取250 μl上清液，混匀后3 000 r/min，离心5 min，取上清140 μl置于无菌1.5 ml EP管备用，使用核酸提取仪，参考试剂盒说明书操作流程步骤处理离心好的上清粪便样本，最后将提取完成的RNA溶液静置、备用。

1.4基因群鉴定 采用实时荧光定量PCR方法对样本基因群进行鉴定，试剂盒选用诺如病毒GI群检测试剂盒、诺如病毒GⅡ群检测试剂盒。按照试剂盒说明书配置反应体系，使用Q5型实时荧光PCR仪进行检测。

1.5基因型检测 使用QiagenOne-Step RT-PCR kit试剂盒对基因群鉴定为诺如病毒GⅡ的阳性标本进行基因型检测。引物扩增ORF1和ORF2的重叠区，GⅡ引物为 MON 431(+)5’-TGG ACI AGR GGⅠ CCY AAY CA-3’和 G2SKR(-)5’-CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT-3’。配置20 μl反应体系: 5×RT-PCRBuffer 5 μl，dNTP mix 1 μl，RT-PCR Enzymemix 1μl，Rnase Inhibitor 11 μl，上下游引物各0.5μl，模板5 μl；PCR仪反应扩增程序为42 ℃ 30 min; 95 ℃ 15 min; 95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40个循环; 72 ℃ 10 min。阳性产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行纯化和测序。

1.6统计学方法 使用SPSS 20.0软件进行数据统计。使用诺如病毒暴发监测网络中数据库BioNumer7.6对序列进行基因型比对。应用DNAstar软件对测序结果进行编辑，根据文献检索，从GenBank中下载国内、外诺如病毒相关序列片段，应用lCusatl W软件进行多序列比对和分析，MEGA7.0软件绘制系统发生树。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1诺如病毒基因群检测结果 2018-2020年收集粪便标本共计679份，阳性率为10.75%(73/679)；2018年诺如病毒阳性检出率是6.77%(9/133)。2019年诺如病毒阳性检出率是为13.42%(20/149)。2020年诺如病毒阳性检出率为11.08%(44/397)。检出的诺如病毒以GⅡ基因群为主(95.89%，70/73)，GI基因群为4.11% (3/73)。2018年、2019年、2020年诺如病毒阳性检出率差异无统计学意义(χ2=3.354，P>0.05)，见表1。

2.2诺如病毒GⅡ基因型分析 70份GⅡ基因群样本测序成功57份，使用诺如病毒暴发监测网络数据库BioNumer7.6对57份样本的聚合酶区和衣壳区序列同时分析，其中，8份样本(GⅡ.17[P17]14.04%，8/57)聚合酶和衣壳区分型结果一致，其余样本在聚合酶区和衣壳区分型结果均不一致，为重组毒株。重组基因型分别是GⅡ.6 [P7](12.28%，7/57)，GⅡ.4[P16](6.90%，4/58)，GⅡ.3[P12](7.02%，6/57)，GⅡ.2[P16](56.14%，32 /57)，见图1。

2.3诺如病毒GⅡ基因型系统进化树构建 选择GenBank中的参考序列(成都MW386187.1，北京MW205667.1，北京MW205630.1，泉州MK671484.1，北京MW205658.1，印度MW362535.1，台州MH842230.1，美国MT344182.1)，与57份样本测序结果构建系统进化树，结果如下：GⅡ.17[P17]出现在2018和2019年，与台州株(2017 MH842230.1)较为接近，变异不明显，核苷酸相似度为98.8%～100%，而与美国株(2020，MT344182.1)距离较远。GⅡ.2[P16]在2018、2019和2020年均有出现，核苷酸相似度为86%～99%，与泉州株(2017 MK671484.1)较为接近，但与北京(2020，MW205658.1)、印度(2020，MW362535.1)距离较远，相似度均为86%。GⅡ.6 [P7]主要出现在2020年，与成都株(2020，MW386187.1)高度同源，核苷酸相似度为100%。GⅡ.4[P16]和GⅡ.3[P12]全部出现在2020年，与北京株(2020，MW205667.1；2020，MW205630.1)高度同源，核苷酸相似度均为100%，见图2。

3 讨 论

急性胃肠炎临床表现主要特征为突发剧烈呕吐(更常见于儿童)、非血性腹泻(在成人中更常见)恶心及腹痛。潜伏期为12～48 h，在健康人群中，症状的持续时间通常不超过48 h，同时多数患者感染呈现自限性，3 d后消失；此病毒可感染所有年龄段人群，诺如病毒可造成全球近1/5的急性肠胃炎病例发生。

引起急性胃肠炎主要的病原体是诺如病毒，诺如病毒属于人类杯状病毒科诺如病毒属，是无包膜的单股正链RNA病毒。基因组全长约7.5 kb，含有3个开放读码框架(three open reading frames, ORFs)，ORF1、ORF2、ORF3。ORF1编码非结构蛋白，ORF2和ORF3编码衣壳蛋白(VP1)和次要衣壳蛋白(VP2)。根据衣壳蛋白VP1氨基酸序列的差异，诺如病毒至少可分为10个不同的基因群(GⅠ-GⅩ)，其中，GⅠ、GⅡ、GⅣ、GⅧ和 GⅨ(以前称为GⅡ.15)可以感染人类[4-5]，GI与GⅡ是导致人类急性胃肠炎发生的主要基因群，近几年，引起急性胃肠炎又以GⅡ基因群为主，GⅡ基因群是全球范围内诺如病毒最流行的基因群。根据病毒RdRp和VP1区的核苷酸序列差异，每个基因群又可进一步分为不同的基因型。作为RNA病毒，诺如病毒极易在ORF1和ORF2交接处发生变异和重组，重组型诺如病毒的多聚酶区和衣壳蛋白VP1区多属于不同基因型。ORF1-ORF2连接区的重组现象发生频繁，新重组型别的出现增加了诺如病毒的遗传多样性，侵袭性更稳定，能够逃避群体免疫的侵袭，具备了更好的人群适应性和传播能力。

本研究结果显示，北京市门头沟区急性胃肠炎诺如病毒阳性检出率是10.75%，与天津市成人急性胃肠炎人群11.77%的阳性检出率[6]，上海市10.87%的阳性检出率基本持平[9]，但低于天津市儿童急性胃肠炎人群26.0%的阳性检出率[7]，高于黑龙江省7.14%的阳性检出率[8]，提示急性胃肠炎诺如病毒阳性检出率可能与年龄结构，地域特征均有关联。

本研究结果显示，北京市门头沟区诺如病毒主要以GⅡ基因群为主，诺如病毒GⅡ基因群占95.89%，GI基因群占4.11%。对57份诺如病毒GⅡ基因群样本的聚合酶区、衣壳区基因序列扩增和序列测定后发现，只有8份样本聚合酶和衣壳区分型结果一致，为GⅡ.17[P17]，其余样本聚合酶区和衣壳区分型结果均不一致，说明诺如病毒GⅡ基因群以重组基因型为主。在重组基因型中，分别有GⅡ.6 [P7]，GⅡ.4[P16]，GⅡ.3[P12]，GⅡ.2[P16]4种重组基因型。其中，GⅡ.2[P16] 在2018、2019和2020年均有出现，占全部检出诺如病毒基因型的56.14%，提示该重组基因型在北京市门头沟区出现流行。自2016年开始，国内广东、香港、北京等地以及德国、法国相继出现的GⅡ.2[P16]重组株引起的诺如病毒感染疫情大幅增加[10-11]，与此同时，系统进化分析表明，2016年以来出现的GⅡ.2[P16]重组株区别于2016年以前的GⅡ.2[P16]，形成了一个相对独立的进化分支，提示北京市门头沟区流行的基因型别是进化的独立分支。门头沟区GⅡ.2[P16]基因型研究结果表明，核苷酸相似度为86%～99%，与泉州株(MK671484.1)2017年度的基因型较为接近，但与北京(MW205658.1)、印度(MW362535.1)2020年基因型距离较远，相似度仅为86%，提示基因型别可能发生了突变，有待进一步研究。

自2012年，GⅡ.4一直是导致全球范围内急性胃肠炎疫情暴发的主要基因型，在我国广州，北京，上海等国内多个城市也发现此基因型的流行；在美国，GⅡ.4基因型导致了急性胃肠炎疫情多次暴发。GⅡ.4的流行趋势一直持续到2014年底，随后GⅡ.17基因型取代了GⅡ.4基因型，成为暴发疫情中的优势基因型；在散发病例中，诺如病毒的流行趋势一直表现为基因型多样性[12]。GⅡ.3，同样是导致诺如病毒感染急性胃肠炎的重要原因，GⅡ.3基因型的感染多发生于12岁以下的儿童，显示该基因型对儿童可能有明显的倾向。本研究同样显示：GⅡ.6 [P7]、 GⅡ.4[P16]和GⅡ.3[P12]基因型均在2020年度检出，且与成都株(2020，MW386187.1)、北京株(2020，MW205667.1；2020，MW205630.1)均高度同源，核苷酸相似度均为100%，提示本区诺如病毒的基因型呈现多基因型并存的趋势。

综上所述，自2018年以来，GⅡ.2[P16]型诺如病毒持续在本地区流行，但诺如病毒GⅡ.6 [P7]基因型，GⅡ.4[P16]基因型，GⅡ.3[P12]基因型的出现，提示病毒基因型构成复杂。诺如病毒株的基因分型具有重要意义，其突变和重组现象可以决定诺如病毒在易感人群中的广泛传播和持续存在[13]。病毒进化可由选择性压力引起的突变和重组所介导，进而导致病毒流行种群不断变化，因此对诺如病毒的分子流行病学监测[14]，特别是监测诺如病毒的基因型和重组基因型的动态流行特征，以评估诺如病毒对公共卫生事业的影响，从而为诺如病毒的预防控制和预测预警提供科学的理论依据。