深海芽孢杆菌Bacillus megaterium LM-44对亚甲基蓝染料的吸附作用

徐湘薇,张 云,胡云峰

(1.中国科学院 南海海洋研究所/热带海洋生物资源与生态重点实验室/广东省海洋药物重点实验室,广东 广州 510301;2.南方海洋科学与工程广东省实验室(广州),广东 广州 511458;3.中国科学院大学,北京 100049;4.中国科学院 南海海洋研究所仪器设备公共服务中心,广东 广州 510301)

偶氮染料是使用量最大的一种染料,广泛应用在印染、纺织、食品等领域[1]。含偶氮染料的废水具有高盐、高碱度等特点,直接排放至水体会造成水体色度污染,降低水体溶解氧含量与透光度,干扰水体生物正常生命活动。此外,偶氮染料的降解产物大多对生物有毒害作用,随水体进入生态循环系统,对人类健康构成威胁[2-6]。亚甲基蓝(methylene blue,MB)是一种典型的偶氮染料,含有难以降解的偶氮结构,颜色鲜艳并且具有较高的吸收波长。微量的MB就可以使水溶液呈现明显的蓝色,直接影响水中生物的光合作用,破坏水体环境,进而危害人类和动物的健康[7-9]。

目前,偶氮染料废水的处理方法主要有化学法、物理法和生物法[10]。其中,微生物吸附法具有来源丰富、品种多样、成本低廉、对环境干扰小、实地操作性强、无毒害降解产物等优点,在污染治理方面具有显著优越性[11]。从真菌、藻类、细菌中都发现了可以吸附染料的微生物,如白腐真菌、芽孢杆菌等[12-13]。Liu等发现解淀粉芽孢杆菌W36具有较强的染料脱色能力[14];苏会敏利用芽孢杆菌对MB进行脱色[15],细菌接种量为3%,pH为5,碳源浓度为10 mg/L,反应120 h,对20 mg/L的MB去除率为84%。细菌具有生长周期短、生长速率高、环境适应性强、易于获取等特点,非常适用偶氮脱色,但其本身易受温度、pH、盐度等条件的影响,且先前研究中都存在反应时间较长、去除作用不稳定等局限性,因此,寻求具有高效、稳定吸附作用的菌株仍然是研究的关键。本课题组前期已经从深海环境中分离了一株芽孢杆菌Bacillussp. LM-24,其在高盐、高pH环境中具有稳定的吸附典型偶氮染料MB作用。本文基于最新发现的一株具有更高吸附率的海洋巨大芽孢杆菌BacillusmegateriumLM-44,利用无机载体硅胶和有机载体大孔树脂对其进行固定化来提高外界环境的稳定性,对其吸附条件进行了优化并分析了其吸附过程,以期为高盐高碱度偶氮染料废水的深度脱色提供微生物种质资源。

1 材料与方法

1.1 材料

BacillusmegateriumLM-44筛选分离于南海深海环境样品;亚甲基蓝等均为分析纯;柱层层析硅胶(200-300目,青岛海洋化工厂分厂);大孔树脂HPD-750S(郑州和成新材料厂);酶标仪(Infinite M200 Pro);恒温摇床(广州湘西生物仪器公司)。

液体Luria-Bertani培养基:10 g胰蛋白胨,5 g酵母粉,10 g NaCl溶于1 L蒸馏水中;固体Luria-Bertani培养基:10 g胰蛋白胨,5 g酵母粉,10 g NaCl,15 g琼脂溶于1 L蒸馏水中。

MB溶液:称取10 mg MB固体于少许水中,搅拌至完全溶解,倒至100 mL容量瓶中定容。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种分离与筛选

取0.5 g南海深海环境样本于10 mL 液体LB培养基中,150 r/min、37 ℃恒温培养1.5 h;用生理盐水将原菌液稀释5倍,吸取200 μL稀释菌液于固体LB培养基表面,倒入5颗玻璃球均匀摇晃,使稀释菌液均匀涂布于培养基表面,37 ℃恒温倒置培养16 h。 从LB平板上挑取不同形态的单个菌落至10 mL新鲜液体LB培养基中, 摇床培养12 h(150 r/min、 37 ℃)。 取2 mL菌液离心, 去上清液后向离心管中加入100 mg/L的MB溶液, 震荡使菌体充分悬浮, 150 r/min振荡反应1 h。 离心后取上清液于665 nm[16]处测量吸光度。

1.2.2 菌株生理生化性质鉴定

生长曲线测定:从LB平板上挑取生长良好的单个菌落至新鲜液体LB培养基中,摇床培养12 h(37 ℃、150 r/min)。以1%接种量转接至新鲜液体LB培养基中,取菌液于600 nm处测量吸光度(间隔2 h)。

耐盐性测定:分别向LB培养液中加入1%～15%的NaCl,以1%接种量将菌液转接至不同含盐量的液体LB培养基中,分别于4、12、24、36 h取菌液于600 nm处测定吸光度。

1.2.3 基因测序分析

吸取1 mL发酵菌液至离心管中低温保存,由上海生工完成16S rRNA测序分析,利用NCBI做在线比对,用MEGA.11构建系统树。

1.2.4 制备游离菌株和固定化菌株

湿菌体制备:从固体LB培养基表面挑取生长良好的单个菌株,于10 mL液体LB培养基中,室温下150 r/min振荡培养12 h,以1%接种量转接至液体LB培养基中,37 ℃、150 r/mim振荡培养12 h。吸取菌液离心,去除上清液,加入无菌水清洗,离心后去上清液,湿菌体备用。

固定化菌株制备:取部分湿菌体,加入与原上清液体积相同的无菌水,震荡充分后加入1%载体,振荡(150 r/min)反应2 h后抽滤,用无菌生理盐水冲洗载体表面,放入50 ℃恒温箱烘干1 h。

1.2.5 吸附优化实验

最适吸附剂浓度测定:MB溶液100 mg/L,游离菌株、硅胶固定化菌株和大孔树脂固定化菌株浓度分别为0.59～23.74 mg/mL、1～10 g/L、1～10 g/L;室温、150 r/min反应1 h后离心,取上清液于665 nm[16]处测量吸光度。

pH对吸附作用的影响:用pH为5.0～10.0的缓冲液溶解MB至100 mg/L,以最适吸附剂浓度加入3种不同吸附剂,室温、150 r/min反应1 h后离心,取上清液于665 nm处测量吸光度。

温度对吸附作用的影响:在最适吸附剂浓度、pH条件下,将3种吸附剂分别置于25、30、35、40、45 ℃恒温摇床中,150 r/min震荡反应1 h。

时间对吸附作用的影响:在最适吸附剂浓度、最佳溶液pH、最适温度的条件下,将吸附剂投入MB溶液中,150 r/min震荡反应,分别于1、5、10、30、60、120、180 min取上清液于665 nm处测量吸光度。

溶液初始浓度对吸附作用的影响:在最适吸附剂浓度、最佳pH、最适时间、最适温度的条件下,将吸附剂分别投入浓度为50、100、200、300、400、500 mg/L的MB溶液中,150 r/min震荡反应,反应结束后离心取上清液于665 nm处测量吸光度。

1.2.6 无机盐对吸附作用的影响

配制13种分别含NaH2PO4、NaCl、乙酸钠、Na2CO3、 NH4Cl、 KCl、 K3PO4、 硫酸铵、 KH2PO4、 MgSO4、MgCl2、CaCl2、BaCl2量为0.002 mol/L和0.01 mol/L的MB溶液,最适反应条件下,分别加入3种吸附剂进行吸附反应。

1.2.7 动力学测定

在最适条件下分别投入3种吸附剂,分别震荡反应1、3、5、10、20、40、60、120、180 min,离心后取上清液于665 nm处测量吸光度。

1.2.8 吸附等温线测定

分别向50～500 mg/L MB溶液中投入3种吸附剂,在最适吸附剂浓度与溶液pH条件下,分别于25、30、35 ℃震荡反应120 min。离心后取上清液于665 nm处测量吸光度。

1.2.9 计算公式

1)去除率与吸附容量

(1)

(2)

式中:Y为MB去除率,%;q为MB吸附容量,mg/g;Ci为MB溶液初始浓度,mg/L;Cf为MB溶液终浓度,mg/L;Cb为吸附剂浓度,mg/L。

2)吸附动力学方程

准一级动力学方程[17]为

qt=qe×(1-e-K1t)

(3)

准二级动力学方程[18]为

(4)

式中:qe为平衡吸附量,mg/g;qt为t时刻吸附量,mg/g;K1为准一级动力学模型吸附速率常数,min-1;K2为准二级动力学模型吸附速率常数,mg/(mg·min)。

3)等温吸附方程

Langmuir等温吸附方程[19]为

(5)

式中:qm为单分子层饱和吸附量,mg/g;KL为Langmuir吸附系数,L/mg;Ce为溶液平衡浓度,mg/L。

Freundlich等温吸附方程[20]为

(6)

式中:KF为Freundlich吸附常数,mg/g;n描述了等温线的变化趋势。

2 结果与讨论

2.1 基因测序比对

从分离菌株中获得了对MB吸附率较高的芽孢杆菌LM-44,菌体呈圆形、白色、质地黏稠。通过16S rRNA测序分析后,将序列上传至NCBI进行在线比对,GenBank序列编号为ON527364。利用MEGA.11软件邻近法制作系统树(见图1),结合比对结果和系统树分析,发现该菌株为芽孢杆菌菌属,与一株巨大芽孢杆菌ROA024高度同源,命名为BacillusmegateriumLM-44。此前也有研究表明,芽孢杆菌在染料脱色领域具有巨大的开发潜力[14]。

图1 系统进化树

2.2 菌种鉴定

生长曲线测定结果显示(见图2),培养10 h左右,菌株生长进入稳定期。研究表明,大多数细菌只能在0～3%盐度下生长,过高盐度会造成细胞损伤。耐盐性测定显示BacillusmegateriumLM-44生长在1%含盐量培养基中生长最佳,盐度超过8%后不再生长(见图3),说明LM-44是一株耐盐菌。

图2 Bacillus megaterium LM-44生长曲线

图3 Bacillus megaterium LM-44生长耐盐曲线

2.3 单因素优化实验

2.3.1 最适吸附剂浓度测定

因为吸附剂对MB具有吸附作用, 去除率随着吸附剂浓度的增加而快速增加。之后,游离菌株、 硅胶固定化吸附剂、 大孔树脂固定化吸附剂吸附率的增长速率分别在吸附剂浓度为1.187、2、8 g/L时开始减缓, 在2.374、 6、 14 g/L时第2次减缓。 而吸附容量随吸附剂浓度增加逐渐降低, 可知随着吸附剂浓度的增加, 吸附剂吸附MB的总量增加, 而单个吸附剂吸附的MB分子数量在逐渐减少, 吸附剂空余的吸附位点逐渐增多。 在实际应用中, 为使吸附剂性能比最优化,需综合考虑去除率和吸附容量, 以减少吸附剂的浪费[21], 选择接近二者交点处, 可同时保证一定吸附效果与较高的吸附容量。 故游离菌株、 硅胶固定化吸附剂、 大孔树脂固定化吸附剂的初始浓度分别选取1.187、2、 8 g/L继续后续实验(见图4)。

图4 吸附剂浓度对吸附作用的影响

2.3.2 pH对吸附作用的影响

pH是影响吸附剂吸附率的重要因素,溶液中pH的变化会影响分子的电离程度以及分子表面性质[22],吸附剂等电点(pHpzc)对吸附剂表面吸附能力和表面活性中心具有决定作用[17,23]。当溶液pH>pHpzc时,有利于吸附剂对阳离子染料的吸附;而当pH

图5 pH对吸附作用的影响

3种吸附剂最佳pH分别为9、9、8。当pH值从最佳pH降至5时,3种吸附剂吸附率下降率分别为37%、38%、14%,大孔树脂固定化吸附剂在不同pH条件下吸附性能比较均一,而硅胶固定化吸附剂在碱性条件下的吸附效果优于在酸性条件下的吸附效果。

2.3.3 温度对吸附作用的影响

温度是另一个重要的物理化学过程参数[24],主要通过影响微生物吸附剂的生理代谢过程、基团吸附热动力和吸附热容等进而影响吸附效果。游离菌株和硅胶固定化吸附剂吸附率随温度升高略有下降(见图6)。

图6 温度对吸附作用的影响

可能是由于温度升高影响了微生物表面的活性位点,但3种吸附剂去除率波动范围不超过9%,说明温度对吸附作用影响不大,BacillusmegateriumLM-44对温度适应性较好。在实际工业应用中,升高温度需要较高成本,在温度影响不大的情况下,选用接近室温操作更符合经济效益,故而此处选用25 ℃继续后续实验。

2.3.4 时间对吸附作用的影响

时间是影响吸附作用的另一主要因素,探究吸附时间对吸附作用的影响,可以帮助确定吸附平衡时间,得到更适用于实际废水处理的参数[25-26]。吸附剂对染料的吸附过程可分2为个阶段(见图7),第一阶段为快速吸附阶段,吸附率会在短时间内快速增加,主要是染料分子从水溶液中被吸附至吸附剂表面;第二阶段为慢速吸附阶段,即吸附率缓慢增长直至稳定,染料分子需克服膜阻力等因素进入微生物内部。测定不同时间下的吸附率发现,游离菌株与硅胶固定化菌株的初始吸附速率要大于大孔树脂固定化菌株,10 min时前2种吸附剂进入了缓慢阶段,30 min接近吸附平衡,即吸附容量达到饱和,吸附率不再随时间增加。而大孔树脂在60 min进入缓慢吸附阶段,大约在3 h左右接近吸附平衡状态。

图7 时间对吸附作用的影响

2.3.5 溶液初始浓度对吸附作用的影响

吸附剂吸附容量高度依赖于初始染料浓度,染料浓度会影响吸附剂表面上的可用位点。一般来说,由于吸附剂表面吸附位点的饱和,染料去除率随着初始染料浓度的增加而降低。另一方面,高初始染料浓度下传质的高驱动力会导致吸附剂容量的增加[27]。测定不同初始浓度的溶液中MB剩余浓度(见图8),可以发现,MB初始浓度从50 mg/L增至500 mg/L,游离微生物平均吸附率下降了52%,硅胶和树脂固定化菌株平均吸附率分别下降23%和45%,说明吸附高浓度MB时,固定化吸附剂的吸附作用要优于游离菌株,其中无机载体硅胶固定化吸附剂的吸附效果最佳。由于高浓度的MB染料具有明显的毒害作用,可能对微生物吸附过程有一定影响,而载体为微生物提供了良好的生长空间,可增加其对外部理化环境的抗性。另外,可能该条件下无机载体硅胶比有机载体大孔树脂更利于菌株的富集。

图8 MB初始浓度对吸附作用的影响

2.4 无机盐对吸附剂吸附速率的影响

如图9所示,一价无机盐对大孔树脂固定化菌株的吸附作用有一定影响,对游离菌株与硅胶固定化菌株影响较小。相较于游离菌株和硅胶固定化吸附剂,大孔树脂固定化吸附剂作用更不稳定,说明一价无机盐可能主要影响了缓慢吸附阶段。二价盐对游离菌株吸附作用影响较小,其中Mg2+对吸附过程体现出了一定促进作用。比对无机盐对硅胶固定化菌株的影响规律发现,PO43-、SO42-、K+、Ca2+、Ba2+对吸附剂有一定抑制作用,吸附率随离子浓度增加而呈现下降趋势。

图9 无机盐对吸附作用的影响

2.5 动力学实验

采用准一阶与准二阶动力学模型拟合吸附剂对MB的吸附动力学,模型参数和相关系数见表1,结果如图10所示,。由拟合结果可以看出,3种吸附剂与2种模型都可以很好拟合,qe值与实际所测值一致,说明3种吸附剂都存在物理吸附和化学吸附。比较R2值得出大孔树脂固定化菌株与准一级动力学拟合度更高,以化学吸附为主,饱和吸附容量与实际测量值更加接近。比较K2值,可推测游离菌株的吸附过程最容易进行,其次是硅胶固定化菌株,最后是大孔树脂固化菌株,这与实际所测结果相符。

表1 准一级、准二级动力学拟合

图10 动力学

由图10可以看出,3种吸附剂达到一定吸附容量后,进入平衡阶段,即吸附容量不再发生改变。其中游离微生物和硅胶固定化微生物在30 min左右接近吸附饱和,而大孔树脂固定化微生物较慢,膜扩散阶段对其影响作用较小,颗粒扩散阶段对其影响较大,在180 min左右达到吸附饱和。故而3种吸附剂分别选用30、30、180 min继续后续实验。

2.6 吸附等温线测定

吸附等温线对于研究吸附剂颗粒与吸附物相互作用的过程具有重要意义, 可以帮助了解吸附背后的机制并提供表面性质、 亲和力和吸附剂吸附能力[28]。 3种吸附剂的吸附容量qe在298.15、 303.15、 308.15 K这3种温度下差异并不明显,qe随着MB溶液初始浓度增加而增加, 已有研究证明初始浓度增加可以有效增加吸附剂吸附容量[25]。采用Langmuir和Freundlich模型进行拟合(见图11), 相关系数见表2和表3。 Freundlich是假设表面非均一的吸附过程, Langumir是基于表面为单层均匀的吸附过程,假设吸附剂表面所有吸附位点能量相同且被吸附的粒子之间相互独立[18]。 比较R2值发现, 固定化吸附剂吸附过程与Langumir模型更贴近,Langumir模型下大孔树脂固定化菌株最大吸附容量为32 mg/g,游离菌株在同等条件下平均吸附容量为153 mg/g,说明大孔树脂固定化吸附剂主要以菌株对MB的吸附作用为主。游离微生物与Freundlich方程式拟合度更高,说明MB分子在游离菌株LM-44上的吸附作用位点是非均一的,不能简单以Langmuir模型估算LM-44最大吸附容量,吸附容量仍可能随反应条件的改变增大。

表2 Langmuir等温线拟合

表3 Freundlich等温线拟合

2.7 Bacillus megaterium LM-44与Bacillus sp LM-24吸附性能比较

本课题组前期分离了一株对典型偶氮染料亚甲基蓝(MB)具有优势吸附作用的芽孢杆菌Bacillussp.LM-24,其在含NaCl超过6%的培养基上不再生长,而BacillusmegateriumLM-44在培养基含NaCl为8%时不再生长,说明BacillusmegateriumLM-44较Bacillussp.LM-24具有更好的耐盐性。比较2种菌株对不同含盐量MB的吸附作用,发现2种菌株吸附作用在含盐量大于4%时依然具有较好的吸附去除效果,低浓度NaCl对其吸附作用有一定影响(见图12)。而染料废水含盐度通常在3%～10%[29-32],说明2株芽孢杆菌适用于处理染料废水。

图12 NaCl浓度对LM-44与LM-24吸附作用的影响

比较最适吸附条件发现(见表4),2种菌株最适吸附条件接近,但LM-44在不同环境pH、温度以及含不同无机盐离子溶液中,呈现出了更好的稳定性。改变初始MB溶液溶度,在吸附100 mg/L的MB溶液时,测得LM-24最大吸附容量为56 mg/g,之后其吸附容量随MB初始浓度升高而减小,而LM-44吸附500 mg/L的MB溶液时,测得吸附容量为153 mg/g, 说明LM-44对高浓度废水仍然具有较好的去除作用。动力学实验发现,6种吸附剂与准一级、准二级动力学都具有较高的拟合度。LM-24游离菌以及其固定化吸附剂都与准二级动力学拟合度更高,以化学吸附为主;LM-44以及其固定化吸附剂都与准一级动力学拟合度更高,以物理吸附作用为主。表明固定化吸附剂的理化吸附作用机制与菌株吸附作用一致。等温线实验表明,LM-24与Langmuir模型拟合度更高,表明其表面吸附位点为均一的,而LM-44与Freundlich模型拟合度更高,即其表面吸附位点为非匀相的[33]。

表4 吸附剂相关系数

3 结论

1)BacillusmegateriumLM-44最高生长耐盐度为8%,一株对MB具有较好吸附作用的耐盐菌,经优化后,游离菌株在最适反应条件(吸附剂浓度1.187 mg/mL、溶液pH=9、温度25 ℃、150 r/min、震荡反应60 min)下,对100 mg/L MB溶液的去除率为70%,吸附容量为50 mg/g,对500 mg/L MB溶液吸附容量为153 mg/g;硅胶固定化吸附剂在最适反应条件(吸附剂浓度2 g/L、溶液pH=9、温度25 ℃、150 r/min、震荡反应120 min)下,对100 mg/L MB溶液的去除率为98%,吸附容量为49 mg/g,对500 mg/L MB溶液的吸附容量为192 mg/g;大孔树脂固定化吸附剂在最适反应条件(吸附剂浓度8 g/L、溶液pH9、温度25 ℃、150 r/min,震荡反应180 min)下,对100 mg/L MB溶液的去除率为82%,吸附容量为10 mg/g,对500 mg/L MB溶液的吸附容量为32 mg/g。

2) 3种吸附剂总体对金属离子有较好的耐受性,共存离子PO43-、SO42-、K+、Ca2+、Ba2+对吸附剂有一定抑制作用。

3) 3种吸附剂均与准一级动力学拟合度更高, 吸附作用均存在化学与物理作用, 但以物理作用为主。 游离微生物与Freundlich模型拟合度更高, 而固定化吸附剂与Langmuir模型拟合度更高。

4) 单因素实验表明,溶液pH、溶液初始浓度对吸附剂吸附作用有较为明显的影响。有机载体大孔树脂固定化菌株吸附性能在不同pH条件下具有优越的稳定性,而无机载体硅胶固定化微生物在碱性条件下吸附作用更为稳定,且适用于吸附高浓度MB。表明固定化BacillusmegateriumLM-44对不同pH、温度、染料浓度的稳定性明显提高,适合处理高盐环境的染料废水,具有制备偶氮脱色吸附剂的潜能。在后续固定化载体和微生物联合研究中,还要扩大对具有高效稳定吸附作用的菌株与最廉价高效载体的筛选,进一步探究载体与微生物之间的作用机制、固定化方法与条件的影响以及长期的环境效应。