铜绿假单胞菌中新型的β内酰胺酶介导的羧苄青霉素抗性

董萌萌,梁清清,张会群,郭子晟,陈 林

(西北大学 生命科学学院/西部资源及现代生物技术教育部重点实验室,陕西 西安 710069)



·化学与化学工程·

铜绿假单胞菌中新型的β内酰胺酶介导的羧苄青霉素抗性

董萌萌,梁清清,张会群,郭子晟,陈 林

(西北大学 生命科学学院/西部资源及现代生物技术教育部重点实验室,陕西 西安 710069)

为了探究铜绿假单胞菌抗羧苄青霉素的机制,通过基因敲除以及克拉维酸钾和羧苄青霉素协同实验对羧苄青霉素抗性菌株进行研究。在对羧苄青霉素具有抗性的转座突变体基础上敲除ampC后,其对羧苄青霉素抗性没有变化;8株羧苄青霉素抗性转座突变体菌株克拉维酸钾协同实验呈阳性。基因组中预测为β内酰胺酶的PA5514基因的敲除突变菌株及过表达菌株对氨苄青霉素以及羧苄青霉素的敏感性也没有变化。结果说明ampC及PA5514表达升高并不是羧苄青霉素抗性转座突变体抗性产生的原因,基因组中存在新的受克拉维酸钾抑制的β内酰胺酶可能是铜绿假单胞菌抗羧苄青霉素的一种新机制。同时，克拉维酸钾与羧苄青霉素联合使用能够提高羧苄青霉素对铜绿假单胞菌抗性菌株的治疗效果。

铜绿假单胞菌;羧苄青霉素;β内酰胺酶;克拉维酸钾

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa, PAO1)是一种重要的机会致病菌,主要感染免疫力低下或者大面积烧伤病人,一旦感染,临床治疗十分困难[1]。抗生素是临床治疗病原菌感染的常用药物,其中β内酰胺类抗生素由于其较强及较广的抗菌能力曾是治疗PAO1感染的有效物质[2]。近年来,由于抗菌药物的滥用和病原菌的交叉感染,PAO1对β内酰胺类抗生素的耐药性越来越强[3]。

铜绿假单胞菌对β内酰胺类抗生素耐药机制相当复杂,基因水平转移[4]、β内酰胺酶的产生[5]、功能蛋白空间构象改变及种间和种内传播[6]等都能导致铜绿假单胞菌耐药性的产生。例如外膜蛋白表达降低或构象改变引起细胞膜通透性降低[3],基因突变导致抗生素靶点改变[6],主动外排[3]以及质粒或整合子介导的耐药基因的传播[7]等,都会使PAO1耐药性升高,进而获得生存优势。除此之外,当环境中持续存在诱发因子时,能够诱导PAO1中抗生素水解酶和钝化酶等的表达,这些诱发因子包括抗生素[5]、氧气[8]以及群体反应引起的生物被膜[9]和丛动[6]等。

β内酰胺酶是PAO1产生耐药的主要原因,PAO1在抗生素压力下可以激活体内多种β内酰胺酶基因的表达[5]。β内酰胺酶主要分为A, B, C, D 4类,其中B类以金属锌离子为活性位点,A, C, D类以丝氨酸为活性位点[10]。β内酰胺酶的主要功能是水解β内酰胺类抗生素,使其失活,无法对菌体造成破坏[11]。克拉维酸作为β内酰胺酶抑制剂,不可逆的与β内酰胺酶结合,使得β内酰胺酶失活,β内酰胺类抗生素能够发挥其功能,但是克拉维酸几乎没有抑菌能力。克拉维酸与β内酰胺类抗生素联合使用对致病菌治疗效果十分明显已经在临床中得到了证实[12]。克拉维酸钾同样具有抑制β内酰胺酶的功能[13]。

实验室前期通过构建转座突变体库获得45个与耐药性相关的基因,其中10个基因突变后菌株对羧苄青霉素抗性明显增强,13个基因突变后菌株对羧苄青霉素抗性减弱[14],因此与羧苄青霉素抗性增加相关的菌株达到了突变体库的22% 以上;对另外一个转座突变体库的15株菌检验发现,其中5个菌株表现为羧苄青霉素抗性。由此可以看到羧苄青霉素抗性变化在转座突变体中占有很大的比例。为了检测突变体中羧苄青霉素抗性增强与哪些因素有关,构建了ampC与PA5514的突变体以及PA5514过表达菌株,并进行滤纸片实验检测羧苄青霉素抗性变化。另外我们对转座突变体中8株羧苄青霉素抗性菌株以及10株羧苄青霉素敏感菌株进行克拉维酸钾与羧苄青霉素协同实验,结果发现ampC及PA5514表达升高并不是羧苄青霉素抗性转座突变体抗性产生的原因,基因组中存在新的条件诱导且受克拉维酸钾抑制的β内酰胺酶可能是铜绿假单胞菌抗羧苄青霉素的一种机制。因此,克拉维酸钾与羧苄青霉素联合使用能够对抗性菌株有很好的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 培养基 LB培养基:10 g/L胰蛋白胨,5 g/L酵母粉,10 g/L氯化钠,pH 7.0;假单胞菌分离琼脂培养基:44.4 g/L假单胞分离琼脂,2%(质量分数)甘油。

1.1.2 试剂与仪器 主要试剂:酵母粉、琼脂、胰蛋白胨(OXOID);质粒微量提取试剂盒及DNA产物纯化试剂盒(北京博大泰克);庆大霉素(Gm)、羧苄青霉素(Cb)、克拉维酸钾(Cla)等(Amresco);Taq酶和dNTP (Takara);其他有机试剂均为国产分析纯。

主要仪器:恒温培养箱(上海实验仪器厂有限公司);恒温培养摇床ZHWY-100B(上海智诚分析仪器制造有限公司);立式高压蒸汽灭菌器(HIRAYAMA);凝胶成像系统(SYNGENE);电泳仪(Bio-RAD)。

1.1.3 菌株、质粒与引物 菌株、质粒与引物见表1。

1.2 铜绿假单胞菌敲除突变体的构建

以PA5514突变体的构建为例。根据铜绿假单胞菌PA5514的基因序列设计引物(引物序列见表1),以PAO1基因组为模板扩增PA5514上下游两个片段,与pEX18Tc连接后得到质粒载体pEX18Tc-PA5514;通过三亲株杂交的方式进行突变体构建,其中供体菌为含有构建质粒pEX18Tc-PA5514的E.coli DH10B,受体菌为PAO1,介导菌是E.coli (pRK2013)。突变体构建的原理是基因同源重组。挑取在含有链霉素(500 μg/mL)的PIA平板上生长的单克隆,通过PCR扩增验证PA5514基因是否被破坏。

表 1 本研究所用菌株、质粒与引物

Tab.1 Barcterial strains, plasmids and primers used in this study

StrainsRelevantcharacteristicsSourcePAO1WildtypeP．aeruginosaPAO1ThislabΔ5514PA5514knockoutmutantofPAO1ThisstudyPA0496TampCampCknockoutmutantoftransponsonmutantPA0496ThisstudyPAO1(pUCP26)ControlstraincontainingplasmidpUCP26inPAO1；TcRThisstudyPAO1(pUCP5514)PA5514overexpressionstrain；containingplasmidpUCP5514inPAO1；TcRThisstudyPA0714T(pUCP26)ControlstraincontainingplasmidpUCP26inPA0714；TcRThisstudyPA0714T(pUCP5514)PA5514overexpressionstrain；containingplasmidpUCP5514inPA0714transposonmutant；TcRThisstudyE．coliDH10BF-mcrAΔ(mrr⁃hsdRMS⁃mcrBC)φ80dlacZΔM15ΔlacX74recA1endA1ar⁃aD139Δ(araleu)7697galUgalKλ-rpsLnupGInvitrogenPA0496TTransposonmutantCbR．[15]PA0646TTransposonmutantCbR．[15]PA0714TTransposonmutantCbR．[15]PA0716⁃17TTransposonmutantCbR．[15]PA2699TTransposonmutantCbR．[15]PA2940TTransposonmutantCbR．[15]PA4554TTransposonmutantCbR．[15]PA4556TTransposonmutantCbR．[15]PA4456TTransposonmutantasacontrol．[15]PA5514mutantprimersUP⁃1：TCGGAATTCTCGTCGCCAAGTCAGTG(EcoRI)DOWN⁃1：AGTTCTAGAGGCTGTCGTTCCATTCGC(XbaI)UP⁃2：TACTCTAGAAACTCGGCTGGTGGGTGG(XbaI)DOWN⁃2：CATAAGCTTCGGCAATACCGTCCACC(HindIII)ThisstudyPA5514complementPrimersP⁃1：AGAGAATTCGGACGGGACAAGGACATC(EcoRI)P⁃2：CATAAGCTTGCATAGCGCCGAGGTGAT(HindIII)ThisstudyPlasmidspEX18TcoriT+sacB+genereplacementvectorwithmultiple⁃cloningsitefrompUC18，TcRThislabpRK2013Broad⁃host⁃rangehelpervector；Tra1，KanR[15]pUCP26MulticopyE．coli⁃P．aenrginosashuttlevectorwithanMCSwithinthelacZfragment；TcRThislabpUCP5514Complementationplasmid，pUCP26withaPCRfragmentcoveringtheentirePA5514gene；TcRThisstudy

TcR:四环素抗性; KanR:卡那霉素抗性;CbR:羧苄青霉素抗性;CbS:羧苄青霉素敏感;

1.3 铜绿假单胞菌过表达菌株的构建

以PA5514过表达菌株构建为例。根据铜绿假单胞菌PA5514的基因序列设计引物(引物序列见表1),以PAO1基因组为模板扩增PA5514完整基因,与pUCP26连接后得到质粒载体pUCP5514,将质粒载体转入到E.coliDH10B中,纯化后转入PAO1菌株中,涂布培养后,挑取在含有Tc的PIA平板上生长的单克隆,提取质粒进行PCR验证,确定PA5514基因是否连接在质粒上。

1.4 滤纸片协同实验

挑取待测菌株单克隆接入到5 mL LB液体中,37 ℃, 200r/min摇床中过夜培养,将菌液浓度OD600调整一致后,取20 μL菌液加入到20 mL固体LB中,混匀凝固后,在滤纸片上点10 μL Cb (50mg/mL)以及5 μL Cla (12 mg/mL),37℃培养14～16 h后观察抑菌圈大小。(注:由于敏感菌株及PA4456的抑菌圈过大影响观察,因此Cb浓度调整为5 mg/mL)

2 结 果

2.1 抗性转座突变体对Cb的抗性与AmpC的表达无关

实验室前期对筛选出的抗生素抗性相关菌株研究时发现,许多转座突变体都对羧苄青霉素表现出明显的抗性;且我们检测另外一个转座突变体库中已经鉴定转座子插入位点的突变体发现,羧苄青霉素抗性菌株的比例为5/15(其中PA4937,PA2645,PA1015,PA5332以及PA5375转座突变体表现出羧苄青霉素抗性),因此可以看出基因突变引起羧苄青霉素抗性的菌株在突变体中所占的比例很高。推测抗性产生的原因可能与突变体中β内酰胺酶的表达升高有关。因此为了排除AmpC的影响,我们在其中一株转座突变体PA0496的基础上构建了ampC的突变,检测发现双突变菌株对于Cb的抗性没有发生明显变化(如图1)。

注:(1): 野生型PAO1;(2): PA4456转座突变体;(3): PA0496 ampC;滤纸片上抗生素从左到右分别为Cb,Cb,Cla图1 羧苄青霉素与克拉维酸钾协同实验Fig.1 The synergistic effect of Cb and Cla

2.2 PA5514不影响PAO1对羧苄青霉素的抗性

铜绿假单胞菌基因组数据库(http://www.pseudomonas.com/)中预测可能的β内酰胺酶共有5个基因,其中4个是已知功能的ampC，ampD，sdsA1和PA5542(Pseudomonas imipenem beta-lactamase PIB-1)。PA5514功能预测为β内酰胺水解酶,为了验证转座突变体羧苄青霉素抗性的增强是否与该基因的高表达有关,我们将pUCP5514质粒转入野生型PAO1和转座突变体PA0714中,并且进行抗生素敏感性实验。结果表明PA5514基因的过表达后,PAO1与转座突变体PA0714对Cb和Amp两种抗生素的敏感性没有变化(如图2),说明转座突变体羧苄青霉素抗性的增强与PA5514的高表达无关。

注:(1)为PAO1 (pUCP26),(2)为PAO1 (pUCP5514),(3)为PA0714 (pUCP26),(4)为PA0714 (pUCP5514),抗生素添加位置左为Cb,右为Amp。图2 滤纸片实验Fig.2 Antibiotics susceptibility test

为了进一步确定基因PA5514的功能是否与转座突变体抗生素敏感性的变化有关,我们构建了PA5514缺失突变体(如图4)并对缺失突变体Δ5514和野生菌株进行了Cb和Amp抗生素敏感性实验,结果发现突变体Δ5514与野生菌株的抑菌圈并无明显差异(如图4)。因此,结果进一步证实PA5514与PAO1的羧苄青霉素抗性无直接关系。

注:培养平板上抗生素的添加位置左为Cb,右为Amp图3 PAO1与Δ5514滤纸片实验Fig.3 The antibiotics susceptibility test in PAO1 and Δ5514

2.3 克拉维酸钾可增加铜绿假单胞菌对羧苄青霉素的敏感性

克拉维酸钾是β内酰胺酶抑制剂,能够不可逆的结合β内酰胺酶使其失活,克拉维酸钾与Cb协同实验结果发现8株羧苄青霉素抗性增强的菌株Cb敏感性增强(如图4)。为了确定转座突变体中转座子pBT20是否与这个现象有关,我们随机选取了1株与β内酰胺类抗生素抗性无关的转座突变体PA4456T,在相同条件下进行协同实验,结果为阴性(如图1)。同时,检测了10株羧苄青霉素敏感菌株的协同作用情况,结果表明羧苄青霉素敏感菌株协同实验呈现阴性(数据未列),结果说明羧苄青霉素抗性菌株抗生素敏感性的变化与转座子无关。

注:图中从左到右分别为羧苄青霉素抗性转座突变体PA4556T，PA2699T，PA0496T，PA0646T，PA2940T，PA4554T，PA0717T，PA0714T,其中Cb为羧苄青霉素,Cla为克拉维酸钾图4 羧苄青霉素抗性转座突变体协同实验Fig.4 The synergistic effect of Cb and Cla in the resistance of transponson-insert mutants to Cb

3 讨 论

铜绿假单胞菌对β内酰胺类抗生素的耐药形势越来越严峻,研究表明,铜绿假单胞菌对β内酰胺类抗生素的耐药往往是多种耐药机制共同作用的结果[2],其中β内酰胺酶在耐药机制中占有重要作用[16]。在对羧苄青霉素抗性的转座突变体进行研究时,我们发现突变转座体库中羧苄青霉素抗性菌株所占比例在30%左右,因此为了探究如此高比例的抗性产生的原因。我们检测了抗性菌株PA0496中外排泵MexAB的表达,发现其表达几乎与野生型中一致(数据未附),排除了外排泵表达变化所引起的抗性变化这一因素。因此我们推测可能是突变菌体中β内酰胺酶表达升高引起的。Choi SH等报道Enterobacterspp.,Serratiamarcescens,Citrobacterfreundii以及Morganellamorganii等细菌在β内酰胺类抗生素的诱导下,编码β内酰胺酶的基因ampC表达升高,并导致药物治疗的失败,同样PAO1在抗生素诱导下也可以产生各种β内酰胺酶包括AmpC,水解β内酰胺类抗生素,从而产生抗性[18]。为了排除AmpC的影响,我们在转座突变体PA0496基础上敲除ampC基因后,双突变菌株的Cb抗性并没有发生明显变化,说明ampC并不影响铜绿假单胞菌的Cb抗性。通过铜绿假单胞菌基因数据库比对发现,编码β内酰胺酶的基因为PA0740,ampC,ampD, PA5514, PA5542,其中PA0740编码金属β内酰胺酶;ampC编码β内酰胺酶,ampD为ampC的调节基因,编码的AmpD蛋白阻遏ampC的表达;PA5542编码亚胺培南水解酶;PA5514可能编码β内酰胺酶[17]。因此,我们在野生型PAO1与转座突变体中过表达PA5514后并构建了基因PA5514缺失突变体,滤纸片实验表明PA5514的表达升高并不会导致菌体Cb抗性增加。

突变体抗性的增加是否是由于其他未知β内酰胺酶的表达升高引起的?为了论证这个猜测我们进行了克拉维酸钾与Cb的协同实验。结果发现羧苄青霉素抗性菌株协同实验呈现阳性(图4)。克拉维酸钾的主要功能是抑制β内酰胺酶的作用[13],因此抗性菌株的出现依然可能是基因组中存在新的条件诱导且受克拉维酸钾抑制的β内酰胺酶。

铜绿假单胞菌在抗生素等压力条件下不断进化,可能通过激活某种低表达的钝化酶或者多种耐药机制来更好地适应环境,获得生存优势[10]。本研究发现克拉维酸钾与羧苄青霉素的联合使用对于治疗铜绿假单胞菌抗性菌株有十分明显的效果,因此对羧苄青霉素抗性菌株的研究让我们对铜绿假单胞菌的耐药机制有更深入的认识,为治疗铜绿假单胞菌感染提供新的思路。

[1] DETTMAN J R, SZTEPANACZ J L, KASSEN R. The properties of spontaneous mutations in the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa[J].BMC Genomics, 2016, 17(1): 27.

[2] 张伦军. 铜绿假单胞菌的耐药性及β-内酰胺酶耐药基因的研究[D].安徽:安徽医科大学, 2013.

[3] 张悦, 梁文, 祁婧, 等. 铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药相关基因的筛选[J].中国科学:生命科学, 2014,44(11): 1159-1167.

[4] 宁唤唤, 李晶, 王严, 等. 铜绿假单胞菌耐药性与致病性共选择机制研究进展[J].中国抗生素杂志, 2015,40(5): 382-388+400.

[5] 刘立坤, 李永乾. 铜绿假单胞菌耐药基因突变与抗菌药物的关系研究[J].河北医科大学学报, 2010,31(8): 987-990.

[6] RAHME C, BUTTERFIELD J M, NICASIO A M, et al. Dual beta-lactam therapy for serious Gram-negative infections: is it time to revisit? [J].Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2014, 80(4): 239-259.

[7] 杜娜, 杜艳. 耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药基因传播机制研究现状[J].微生物学免疫学进展, 2015,43(5): 78-82.

[8] KARLOWSKY J A, HOBAN D J, ZELENITSKY S A, et al. Altered denA and anr gene expression in aminoglycoside adaptive resistance in Pseudomonas aeruginosa[J].The Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 1997, 40(3): 371-376.

[9] DUBERN J F, DIGGLE S P. Quorum sensing by 2-alkyl-4-quinolones in Pseudomonas aeruginosa and other bacterial species[J].Molecular BioSystems, 2008, 4(9):882-888.

[10] 唐瑜, 蒋晓飞. 铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物耐药机制的研究进展[J].国外医药(抗生素分册), 2015,36(2):49-54.

[11] 梁文, 李博, 董萌萌,等. 铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制研究进展[J].中国抗生素杂志, 2013,38(9):641-646.

[12] HAESEKER M, HAVENITH T, STOLK L, et al. Is the standard dose of amoxicillin-clavulanic acid sufficient?[J]. BMC Pharmacology & Toxicology, 2014, 15:38.

[13] CIELECKA-PIONTEK J, SZYMANOWSKA-POWALOWSKA D, PACZKOWSKA M, et al. Stability, compatibility and microbiological activity studies of meropenem-clavulanate potassium[J].The Journal of Antibiotics, 2015,68(1):35-39.

[14] 陈林, 杨亮, 赵兴艳, 等. 铜绿假单胞菌耐药性相关基因的筛选及鉴定[J].中国科学:生命科学, 2010,40(10): 978-982.

[15] HOANG T T, KARKHOFF-SCHWEIZER R R, KUTCHMA A J, et al. A broad-host-range Flp-FRT recombination system for site-specific excision of chromosomally-located DNA sequences: application for isolation of unmarked Pseudomonas aeruginosa mutants[J].Gene, 1998, 212(1):77-86.

[16] 杨菁菁, 艾效曼, 胡云建, 等. 泛耐药铜绿假单胞菌对β内酰胺类抗生素的耐药机制研究[J].中国感染与化疗杂志, 2013,13(1): 14-18.

[17] 赵付菊. ampD基因突变对AmpCβ-内酰胺酶由野生型向持续高产型转变作用的研究及泛耐药鲍曼不动杆菌耐药性和同源性初步分析[D].上海：复旦大学, 2013.

[18] 孙青菊, 梁冰. 铜绿假单胞菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药及传播机制的研究进展[J].微生物与感染, 2013,8(2): 110-114.

(编 辑 陈镱文)

Carbenicillin Resistance Conferred by Uncharacterizedβ>Lactamase inPseudomonasaeruginosa

Dong Mengmeng, LIANG Qingqing, ZHANG Huiqun, GUO Zisheng, CHEN Lin

(Molecular Microbiology Laboratory, College of Life Sciences, Northwest University, Xi′an 710069， China)

To characterize the mechanism of carbenicillin resistance inPseudomonasaeruginosatransponson mutants. The mutant lackingampCon PA0496T background caused no change to carbenicillin susceptibility. Eight transposon mutants showed a reduced susceptibility when carbenicillin was combined with theβ-lactamase inhibitor clavulanate. Overexpression or deletion of a putativeβ-lactamase gene PA5514 also had no effect on the susceptibility to carbenicillin inPseudomonasaeruginosa. The results showed that a new uncharacterizedβ-lactamase inPsedumonasgenome might contribute to carbenicillin resistance. Carbenicillin combined with cavulanate exhibited inhibitor activity and could potentially be used to treat patients with currently pseudomonas infection.

Pseudomonasaeruginosa; carbenillin; beta lactamase; clavulanate potassium

2016-02-29

国家自然科学基金资助项目(31570131);教育部创新团队支持基金资助项目(IRT-15R55);陕西省教育厅专项科研计划基金资助项目(14JK1739)

董萌萌,女,陕西礼泉人，从事微生物相关研究。

R364.5

A

10.16152/j.cnki.xdxbzr.2016-06-010