柠檬桉果实中皂苷的提纯及抗氧化活性

暴玮，屈恋，马丽，赖芳，李伟光，刘雄民*

(1.桂林理工大学 南宁分校，广西 南宁 530001； 2.广西大学 化学化工学院，广西 南宁 530004)

0 引言

柠檬桉(Eucalyptuscitriodira)被引进中国已有70多年的历史，是桉树大家族中的佼佼者。喜温暖气候，有较强的耐旱力，现多种植于广东、福建、广西、四川等地。柠檬桉可谓全身是宝：柠檬桉的树干主要应用于工矿、建筑、交通、造纸等方面；柠檬桉边材富含淀粉，其枝丫可用于培养白木耳；柠檬桉叶可用来提炼香油、香料及用作药材。柠檬桉一年两次开花，花期甚长，是重要的蜜源树种。目前，柠檬桉的果实也成为研究的热点之一，其果实提取得到的单宁、黄桐在医药方面具有较好的消炎解毒、抑菌杀菌作用[1-2]。

皂苷(saponin)又名皂素，一般分为三萜类皂苷和甾体皂苷，广泛存在于植物茎、叶和根中，植物中皂苷的提取方法有醇浸提法、回流法等，其纯化方法主要分为萃取法、沉淀法和大孔吸附树脂吸附法等[3-4]。皂苷是一种具有较好的抗炎、抗癌、抗血栓、抗氧化、抗肿瘤和抑制细胞凋亡等生物活性的天然化合物[5-7]。在抗氧化活性方面，植物皂苷主要是通过对自由基的清除作用来达到保护肝脏的作用。目前，国内外对于柠檬桉的果实研究较少，对果实中皂苷的提取及生物活性研究更是鲜见报道，为提高柠檬桉的综合利用率，笔者选择柠檬桉的果实进行皂苷的提取纯化并进行抗氧化活性的研究。

1 实验

1.1 实验原材料

柠檬桉果实：采自广西南宁市广西大学校园内。

新鲜果实采集后，经60 ℃烘干，人工粉碎后经40目尼龙筛后密封保存。

1.2 主要实验仪器

紫外-可见分光光度计(UV-2550型，生产于日本Shimadzu公司)；恒温水浴振荡器(SHA-BA型，生产于金坛市易晨仪器制造有限公司)；离心机(TDZ5-WS型，生产于长沙高新技术产业开发区湘仪离心机有限公司)；旋转蒸发仪(RE-52AA型，生产于上海利闻科学仪器有限公司)；电子天平(JJ1000Y型，生产于常熟双杰测试仪器厂)；恒温干燥箱(DHG-9011A型，生产于上海精宏实验设备公司)。

1.3 实验试剂

齐墩果酸(分析纯，购于西安欣禄生物科技有限公司)；抗坏血酸(分析纯，购于北京索莱宝科技有限公司)；高氯酸、丙酮、正丁醇、冰醋酸、香草醛、乙醚等(分析纯，购于广东光华化学厂有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 皂苷的提取

称取5.0 g处理过的柠檬桉果实样品，加入40 %的乙醇水溶液使得液料比为20∶1，设置辅助超声条件为功率800 W，温度40.0 ℃，时间45 min，提取完成后用离心机离心后进行过滤，得到粗提液。

1.4.2 皂苷的纯化

① 大孔树脂吸附法[8]：选择D101型大孔吸附树脂进行皂苷粗提物的纯化，称取10 g已预处理的大孔树脂，装柱完成后，多次量取150 mL的粗提液上柱，收集柱下液，分别考察吸附流速、吸附质量浓度对吸附效果的影响。吸附完成后，再考察洗脱流速对解吸率和回收量的影响。

② 正丁醇萃取法[9]：将提取得到的皂苷粗提液减压浓缩，再用等体积乙醚对浓缩液萃取3次，接着用水饱和的正丁醇对水层萃取6次，减压浓缩上层液相，得到皂苷纯化物。

③ 乙醚沉淀法[10-11]：在粗提液中加入乙醚溶液，混合均匀后静置，离心分离所生成的沉淀物，将分离后的沉淀物用甲醇溶液溶解，再加入乙醚溶液使之产生沉淀、分离，如此反复进行至沉淀后的上清液澄清无色后，将最终分离得到的沉淀用水溶解，即为皂苷纯化物。

1.4.3 皂苷的分析

分别移取浓度为0.07 mg/mL的齐墩果酸标准溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL于10 mL容量瓶中，加入5 %香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和0.8 mL的高氯酸，在(70±1)℃条件下水浴加热15min，取出后快速置于冰水中5 min，然后加入5 mL冰醋酸，摇匀后静置22 min，用紫外-分光光度仪测定各样品的吸光度，绘制线性方程，同样的方法测定提取液中皂苷的浓度。

1.4.4 皂苷的抗氧化活性

配制一系列不同浓度的粗提液、正丁醇萃取纯化液、乙醚沉淀纯化液、大孔树脂纯化液，参照文献[4]和文献[12]的方法分别测定皂苷对DPPH·及·OH自由基的清除作用、总抗氧化性。

2 实验结果与讨论

2.1 柠檬桉果实中皂苷的提取

将提取得到的皂苷样品煮沸，振荡后可观察到明显的蜂窝状泡沫，且在15 min内不消失，同步空白无此现象，证明提取样中存在皂苷。

按照1.4.3节分析方法，以齐墩果酸的质量浓度为横坐标，纵坐标为最大吸光度，制作标准曲线，得到线性方程为y=45.968x-0.046 5，R2=0.999 1。准确量取0.05 mL皂苷粗提液，显色后测定其中皂苷的含量，平行测定3次，结果如表1所示。

表1 粗提液中皂苷含量的测定Tab.1 Determination of saponin in crude extract

2.2 粗提液中皂苷的纯化

2.2.1 大孔树脂吸附法工艺优化

① 上样流速的选择

上样流速与皂苷的吸附率的关系见图1。由图1可知，保持上样浓度一致，设置的上样吸附流速越大，皂苷的吸附率越低。当上样流速分别为0.5、1.0 mL/min时，皂苷的吸附率相差不大，综合考虑工作效率和实验时间成本，选择1.0 mL/min为最佳上样流速。

② 样品质量浓度的选择

样品质量浓度与皂苷吸附效果的关系见图2。由图2可知，随着样品质量浓度的增大，皂苷的吸附率先增大后降低，在样品质量浓度为0.38 mg/mL时树脂吸附饱和，此时的树脂吸附率为91.18 %，吸附量为0.35 mg/mL；当样品质量浓度设置为0.50 mg/mL时，吸附率为90.13 %，但是吸附量可以达到0.45 mg/mL。综合考虑吸附工作效率，以0.50 mg/mL为最佳上样浓度。

③ 洗脱流速的选择

设置上样流速为1.0 mL/min，上样浓度为0.50 mg/mL时，考察洗脱流速对皂苷解吸率的影响(图3)。由图3可知，随着洗脱流速的增大，皂苷的解吸率先增加后降低，当洗脱流速为1.5 mL/min时，解吸率最大。因此选择1.5 mL/min为皂苷的最佳解吸流速。

图1 上样流速与皂苷的吸附率的关系Fig.1 Relationship between flow rate and adsorption rate of saponin

图2 样品浓度与皂苷吸附效果的关系Fig.2 Relationship between the concentration and the adsorptive effect of saponin

图3 洗脱流速与皂苷解吸率的关系Fig.3 Relationship between elution flow rate and desorption rate of saponin

2.2.2 纯化方法对皂苷纯度的影响

在大孔树脂最佳纯化工艺条件基础上，分别采用大孔树脂吸附法、乙醚沉淀法和正丁醇萃取法对粗提物进行纯化，得到的纯化物纯度如表2所示。3种方法纯化后，其纯度分别提高为粗提物的1.87倍、3.08倍和2.37倍。

表2 纯化方法对皂苷纯度的影响Tab.2 Effect of purification methods on the purity of saponins

2.3 皂苷的抗氧化活性

2.3.1 总抗氧化性的测定

在皂苷浓度为0.01～0.1 mg/mL的范围内，以抗坏血酸作为参照物，考察不同纯度的皂苷浓度对总抗氧化性的影响(图4)。由图4可知，皂苷浓度增加时，总抗氧化能力也逐渐增强。各样品的总抗氧化性大体上是与纯化物的纯度成正比，其性能从小到大依次为抗坏血酸、大孔树脂纯化物、正丁醇萃取物、粗提物、乙醚沉淀物。其中，粗提物中由于含杂质较多，包括一些抗氧化性能更好的成分，因而表现出较好的抗氧化性能。

图4 皂苷不同质量浓度试样的总抗氧化性Fig.4 Total oxidation resistance of samplesin different concentration

2.3.2 DPPH·清除率的测定

在皂苷浓度为0.001～0.01 mg/mL的范围内，以抗坏血酸作为参照物，考察各样品对DPPH·自由基清除率的影响(图5)。由图5可知，随着皂苷浓度的增加，各样品对DPPH·的清除率均呈上升趋势，在样品浓度为0.01 mg/mL时清除率达到最大，其中抗坏血酸的清除率最高，其他样品对DPPH·自由基的清除能力从小到大依次为大孔树脂纯化物、乙醚沉淀物、正丁醇萃取物、粗提物。

图5 不同质量浓度试样的DPPH·清除率Fig.5 DPPH· scavenging rate of differnent samples

从IC50值来看，对DPPH·自由基的清除能力从小到大依次为抗坏血酸、正丁醇萃取物、大孔树脂纯化物、粗提物、乙醚沉淀物，在三种皂苷纯化物中，大孔树脂纯化物对DPPH·的清除效果较差，其可能的原因为大孔树脂纯化后得到的杂质较多，导致对DPPH·的清除率较低。

表3 不同样品的抗氧化活性Tab.3 Antioxidant activity of different samples

2.3.3 ·OH清除率的测定

在皂苷质量浓度为0.1～1.0 mg/mL的范围内，以抗坏血酸作为参照物，考察各样品对·OH清除率的影响(图6)。由图6可知，随着皂苷浓度的增加，各样品对·OH的清除率呈明显上升趋势，在样品浓度为1.0 mg/mL时清除率相对较大，对·OH的清除能力从小到大依次为大孔树脂纯化物、抗坏血酸、粗提物、正丁醇萃取物、乙醚沉淀物，基本与样品纯度成正比。

图6 不同质量浓度试样对·OH的清除率Fig.6 ·OH free radical scavenging rate of different samples

3 结论

① 采用超声波辅助溶剂法对柠檬桉果实中的皂苷进行了提取，提取得率为18.41 %。分别采用大孔树脂吸附法、乙醚沉淀法和正丁醇萃取法对粗提物进行纯化，经3种方法纯化后，其纯度分别提高为粗提物的1.87倍、3.08倍和2.37倍。

② 进行了D101型大孔树脂吸附法的纯化工艺优化，得到最佳纯化工艺为：上样流速为1.0 mL/min为，上样的样品浓度为0.50 mg/mL，洗脱流速为1.5 mL/min，在此条件下，皂苷的纯度可以提高到34.37 %。

③ 分别对皂苷提取物及纯化物进行抗氧化活性研究：各试样的总抗氧化性与试样的纯度成正比，总抗氧化性从小到大依次为抗坏血酸、大孔树脂纯化物、正丁醇萃取物、粗提物、乙醚沉淀物；对DPPH·自由基的清除能力从小到大依次为大孔树脂纯化物、乙醚沉淀物、正丁醇萃取物、粗提物；对·OH的清除能力基本与其纯度成正比，清除能力从小到大依次为大孔树脂纯化物、抗坏血酸、粗提物、正丁醇萃取物、乙醚沉淀物。