基于碲化镉量子点荧光恢复的BSA传感

杨丛远，韩镇龙，孙悦，肖丹，温荣辉,3,4，何熙璞*,3,4

(1.广西大学 化学化工学院, 广西 南宁 530004；2.广西大学 生命科学与技术学院, 广西 南宁 530004；3.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室, 广西 南宁 530004；4.广西甘蔗生物学重点实验室, 广西 南宁 530004)

0 引言

近年来量子点作为一种荧光探针被普遍应用在生物成像、生物标记及诊断等领域[1]，主要方式有细胞成像、生物活体成像、免疫层析快速诊断等[2-4]。ZHANG等[5]提供了一种非晶碳纳米颗粒的简单制备程序，并使用制备出的碳纳米粒子作为标记物来检测三种镰刀菌真菌毒素。

目前针对病毒的主要检测分析方法有酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和基于聚合酶链式反应法(polymerase chain reaction，PCR)，但两种方法均耗时且费用昂贵[6-8]。

病毒引起的疾病大多传播速度快、致病性高，例如2013年爆发的H7N9型禽流感和2020年爆发的新型冠状病毒等，因此及时发现潜在病患并进行防疫非常重要。2015年，WU等[9]开发了一种基于免疫磁纳米球和抗体偶联的量子点来检测H7N9病毒的方法，可以对其进行快速定量检测。针对2020年爆发的新型冠状病毒肺炎，GORSHKOV等[10]使用与QDs共轭的重组受体结合结构域生成了多功能成像探针，该探针能够与ACE2共轭的金纳米颗粒进行能量转移猝灭，从而能够监测溶液中的结合事件，中和抗体和重组的人ACE2阻断了淬灭作用，证明了特异性的结合相互作用。因此采用纳米生物传感可以在几分钟内检测到样品，相较其他方法省时且简便，在大规模筛选中非常有优势[11-12]。

碲化镉量子点(cadmium telluride quantum dots，CdTe QDs)和碳量子点(carbon quantum dots，C QDs)属于发光半导体纳米晶体，它们荧光强度高，光稳定性好，不受当前有机染料的限制，具有窄的荧光发射光谱的宽吸收光谱[13-14]，非常适合于传感和生物技术应用。并且这两种量子点的荧光发射峰及紫外吸收峰无重叠，二者易于区分。基于CdTe QDs和C QDs的这种特征，本文构建了一种基于CdTe QDs和C QDs的纳米生物传感，并使用牛血清蛋白(bovine serum albvmin, BSA)测试了其可行性。传感器的生物供体部分由针对BSA的特异性抗体(immunogloblin G, IgG)组成，能够检测溶液中同源抗原BSA的存在。在反应中，抗原-抗体分子之间的相互作用产生供体-受体复合物IgG-CdTe QDs+BSA-C QDs，IgG-CdTe QDs(供体)和BSA-C QDs(受体)接近，导致CdTe QDs荧光发射强度显著降低，即BSA-C QDs淬灭了IgG-CdTe QDs的荧光。向溶液中加入游离抗原使游离BSA取代BSA-C QDs导致CdTe QDs荧光强度恢复，通过检测量子点荧光强度的变化，可实现对BSA的检测。

1 实验

1.1 仪器与试剂

仪器：多功能微孔板检测仪(型号：Spark瑞士TECAN公司)；紫外-可见分光光度计(型号：Shimadzu UV-1800日本Shimadzu公司)；pH计(FE28-Bio METTLER TOLEDO)。

试剂：CdCl2·2.5 H2O；巯基乙酸；碲粉；硼氢化钠；NaOH；柠檬酸钠；尿素；硫脲；N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)等试剂均为分析纯。牛血清白蛋白抗体。实验用水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1 水溶性量子点的合成

① CdTe水溶性量子点的合成 参照文献[15]报道的方法，并对其做了适当的修改，合成CdTe QDs。在三口烧瓶中加入10 mL蒸馏水，通氮气5 min除氧，迅速加入0.1 g Te粉，0.3 g NaBH4，塞住瓶口，90 ℃回流搅拌加热3 h，使二者充分反应至黑色Te粉消失。在氮气保护下，在100 mL蒸馏水中加入0.4 g CdCl2·2.5H2O，然后在250 μL TGA存在下，控制pH=10，搅拌下迅速加入新鲜制备的NaHTe溶液，继续于90 ℃下加热搅拌回流不同时间，即得不同颜色的水溶性CdTe量子点。为了后续有效偶联CdTe QDs-IgG，将所合成的CdTe QDs使用无水乙醇进行洗涤纯化，8 000 r/min离心10 min，弃去上清液，洗涤3次后，将沉淀真空浓缩后得到固体粉末备用。

② 碳量子点的制备 参照文献[16]的方法并做适当修改，合成C QDs。按照1∶9∶3摩尔比称取柠檬酸钠∶尿素∶硫脲溶于蒸馏水中，将混合液转入到聚四氟乙烯为内衬的反应釜中，放入180 ℃烘箱加热6 h，待反应结束冷却至室温，得到黄棕色的碳量子点。

1.2.2 BSA抗原/抗体的标记

① BSA抗体的标记 参照文献[17]，将一定量的CdTe QDs(20 mg/mL)、牛血清蛋白抗体(IgG)(5 mg/mL)和EDC(4.2 mg/mL)混合，随后加入PBS溶液使混合溶液的体积达到1 000 μL。将混合溶液在室温下搅拌2 h使其充分反应，然后将溶液在4 ℃下12 000 r/min离心10 min分离制备的CdTe QDs-IgG混合物，将溶液避光保存在4 ℃冰箱内备用。

② BSA抗原的标记 参照文献[18]对BSA进行标记。为了用C QDs标记BSA，首先将含有EDC(6.4 mg/mL)和NHS(4.5 mg/mL)新鲜制备的溶液加入到一定量0.08 mg/mL的C QDs中，并将其避光温浴于37 ℃的深水浴中。然后，将BSA逐滴添加至溶液中，并通过添加Tris缓冲液(6 mg/mL，pH=7.2)终止反应。为了分离C QDs标记的抗原(C QDs-BSA)，将混合物以12 000 r/min离心10 min并将上层相用500 μL Tris缓冲液稀释，并在4 ℃下储存直至使用。

1.2.3 荧光猝灭效率的测定

根据公式(1)

E=1-(F/F0)。

(1)

估计荧光猝灭效率(E)，其中F和F0分别是存在和不存在受体的情况下供体的荧光强度。为了确定最佳荧光淬灭效率，将不同浓度的C QDs-BSA依次添加至恒定浓度的CdTe QDs-IgG。即使用荧光分光光度计测试了体积比分别为1∶10，2∶10，3∶10，4∶10，1∶2，1∶1，2∶1的C QDs-BSA和CdTe QDs-IgG偶联物。

1.2.4 构建检测牛血清白蛋白的生物传感

为了评估本研究开发的纳米生物传感检测BSA的能力，将CdTe QDs-IgG加入到pH=9的PBS缓冲液中。然后将C QDs-BSA加入溶液中并温浴3 min以确保形成CdTe QDs-IgG和C QDs-BSA的免疫复合物，再将BSA加入含有CdTe QDs-IgG和C QDs-BSA的反应混合物中并温浴5 min。反应结束后在360 nm激发该溶液并记录发射光谱。

2 结果与讨论

2.1 量子点的表征

图1是制备的碲化镉量子点和碳量子点的透射电镜图，从图1可以观察到制备的量子点均为圆形，颗粒均匀，具有良好的分散性。其中碲化镉量子点的粒径约为10 nm，碳量子点粒径在5 nm以内。HR-TEM插图显示两种量子点均具有明显的晶格条纹，CdTe QDs的晶格间距为0.34 nm，对应晶面(111)，C QDs的晶格间距为0.21 nm，对应晶面(100)。

(a) 碲化镉量子点的透射电镜图

(b) 碳量子点的透射电镜图

2.2 量子点偶联抗原/抗体

2.2.1 量子点与牛血清白蛋白抗原/抗体的偶联

图2(a)是碲化镉量子点标记牛血清白蛋白抗体前和标记后的紫外吸收对比图，图2(b)是碳量子点标记牛血清白蛋白抗原前和标记后的紫外吸收对比图，可以观察到偶联蛋白后的量子点相对偶联前量子点的紫外最大吸收波长发生了移动，说明量子点和蛋白偶联时一定程度上改变了量子点理化性质和表面结构，证实了二者的成功偶联[19]。

(a) 碲化镉量子点的紫外吸收光谱

(b) 碳量子点的紫外吸收光谱

2.2.2 碲化镉量子点标记牛血清白蛋白抗体

① pH值的影响

由于蛋白质表面离子化侧链可以被滴定，会有一个相应的pH值使对应的蛋白表面静电荷为零，这个pH值即为蛋白的等电点(protein isoelectric point，PI)[20]。当溶液的pH值小于蛋白质的PI值，蛋白带正电，易与CdTe QDs表面的羧基反应产生沉淀。

由图3可以观察到固定加入体系中的反应物的量，使用不同pH值的PBS缓冲液做溶剂偶联碲化镉量子点与牛血清白蛋白抗体，当PBS缓冲液偏酸性时，CdTe QDs与牛血清白蛋白抗体会团聚产生沉淀，溶液无荧光；当PBS缓冲溶液的pH=9时，体系CdTe QDs荧光强度最大，且体系发光较稳定，因此本实验选择pH=9的PBS缓冲液对CdTe QDs与IgG进行偶联。

(a) pH值对CdTe QDs-IgG荧光光谱的影响

(b) pH值对CdTe QDs-IgG在550 nm处荧光光谱的影响

图4 EDC用量对CdTe QDs-IgG影响的荧光光谱图Fig.4 Fluorescence spectra of effect of EDC concentration on CdTe QDs-IgG

② EDC用量的影响

蛋白质与量子点的结合有多种方式，其中最广泛使用的是使用EDC以及NHS或sulfo NHS将抗体上的氨基或羧基与量子点的游离羧基或氨基进行交联，EDC先与量子点上的羧基结合，随后与抗体表面上存在的氨基形成酰胺键[21]。为此，本文通过调节EDC的用量，研究了EDC对活化CdTe QDs的影响。

图4为不同配比EDC活化CdTe QDs使其与IgG偶联的荧光光谱。将相同量的CdTe QDs、 IgG和不同量的浓度为4.2 mg/mL的EDC溶液混合。当EDC加入量过多时，会导致量子点团聚沉淀，使其荧光强度大大降低，因此为了更好地活化量子点以提高酰胺键的转化率，我们后续进行CdTe QDs标记IgG时CdTe QDs与EDC的反应质量比为1∶2。

2.3 构建生物传感检测牛血清白蛋白

由公式(1)可知生物传感的荧光淬灭效率直接取决于C QDs-BSA和CdTe QDs-IgG的比例。图5为使用荧光分光光度计测试体积比分别为1∶10，2∶10，3∶10，4∶10，1∶2，1∶1，2∶1的C QDs-BSA和CdTe QDs-IgG偶联物的淬灭效率。由图5可以观察到，随着C QDs-BSA与CdTe QDs-IgG比例的增加，淬灭效率逐渐增大，当比例达到1∶2时，淬灭效率最大，当C QDs-BSA与CdTe QDs-IgG的比例大于1∶2时，过量的C QDs-BSA不参与免疫复合物的形成，淬灭效率增大到最大后保持恒定。如图6所示，在C QDs-BSA与CdTe QDs-IgG的比例为1∶10至1∶2时，根据公式(1)得出Stern-Volmer曲线是线性的，说明此生物传感的淬灭为单一类型的淬灭。

图5 不同体积比C QDs-BSA /CdTe QDs-IgG荧光淬灭效率Fig.5 Fluorescence quenching efficiency of CdTe for different Volume ratios of C QDs-BSA to CdTe QDs-IgG

图6 Stern-Volmer曲线I0/I与碳量子点浓度函数曲线Fig.6 Stern-Volmer plot I0/I against C QDs concentration function curve

在本研究中，构建了CdTe QDs-IgG/C QDs-BSA纳米生物传感检测BSA。图7为量子点构建生物传感检测BSA的荧光图谱，其中CdTe QDs-IgG的荧光发射强度约为130 000 a.u.，向其中添加C QDs-BSA形成免疫复合物后，该峰值降至80 000 a.u.左右，此为基线光谱。随后，向免疫复合物中添加游离的BSA可使基线的CdTe QDs荧光发射强度增加。这是由于添加了游离抗原，复合物中C QDs-BSA部分被样品中游离的BSA代替，C QDs-BSA对CdTe QDs-IgG的淬灭能力降低，导致了荧光曲线强度的恢复。

图7 基于碲化镉量子点的纳米生物传感的构建Fig.7 Construction of nano biosensor based on CdTe quantum dots

为了评估开发的纳米生物传感检测BSA的能力，使用BSA检测其荧光变化，测试纳米生物传感的特异性。向CdTe QDs-IgG/C QDs-BSA免疫复合物中加入10 μL不同浓度的BSA(1.25、2.5、5、10、20、40 mg/mL)，CdTe QDs-IgG在λmax=550 nm附近的荧光强度恢复，由此得出体系中CdTe QDs-IgG的发射光谱变化与BSA的最终浓度直接相关(图8)。在加入较低浓度BSA时，可观察到随BSA浓度的增加CdTe QDs荧光恢复较明显，当继续加入较高浓度的BSA，CdTe QDs-IgG的荧光强度恢复较为缓慢，得到对应的方程为y=2 985.6 ln(x)-4 715.1，其相关系数R2=0.949 9(图9)，可对BSA进行定量检测。

图8 BSA用量对纳米生物传感荧光强度的影响Fig.8 Effect of BSA concentration on fluorescence intensity of nano biosensor

图9 CdTe QDs-IgG荧光强度随BSA浓度变化曲线Fig.9 Linear relationship between fluorescence intensity of CdTe QDs-IgG and BSA concentration

3 结论

在本研究中，采用简单的方法合成了CdTe QDs和C QDs，合成的两种量子点颗粒大小相对均匀，紫外吸收波长与荧光发射波长均无重叠，可简单区分二者，合成的两种量子点可以分散在水中，方便进行后续生物实验。

使用BSA和相应的抗体IgG作为抗原-抗体系统，开发并证实了基于荧光淬灭及荧光恢复的CdTe QDs和C QDs检测BSA的纳米生物传感器。使用CdTe QDs偶联IgG，C QDs偶联BSA后，将二者混合使其形成免疫复合物，构建纳米生物传感检测BSA。向免疫复合物中加入游离的BSA，溶液中C QDs-BSA部分可以被游离的BSA取代，C QDs-BSA对CdTe QDs-IgG的淬灭能力降低，通过观察CdTe QDs的荧光强度变化，可以判断溶液是否含有BSA。在较低浓度BSA存在下，CdTe QDs的荧光强度恢复明显，当继续加入较高浓度的BSA，CdTe QDs的荧光强度恢复较为缓慢，得到对应的方程为y=2 985.6 ln(x)-4 715.1，其相关系数R2=0.949 9。

构建的纳米生物传感可有效检测BSA，此方法操作简便，对操作人员的技术要求不高，为后续拓展应用于检测其他物质提供新思路。