一枝黄花含漱液质量标准研究

曾茂贵，张 宽，谢晶心，郑文炜，黄飞翔

（1.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003；2.福建省医疗机构中药制剂重点实验室，福建 福州 350003）

一枝黄花为菊科植物一枝黄花Solidago decurrensLour. 的干燥全草［1］，性辛苦凉，归肺、肝经，其本草考证最早始载于《植物名实图考》［2］，具有清热解毒、疏散风热的功效。一枝黄花提取物具有杀菌、消炎、抗肿瘤、降脂、降糖等多种药理活性［3-6］，其对细菌和真菌具有较好的抑制和杀灭作用［7］，临床常用于口臭、口腔溃疡、口腔炎等口腔疾病的预防及治疗［8-11］。一枝黄花含漱剂是福建中医药大学附属第二人民医院制剂中心拟开发的中药单方制剂，具有安全无毒、使用方便快捷、适用人群广泛、价格便宜等特点。已有研究表明黄酮类和酚酸类成分是其抗菌消炎的主要药效物质［3，12］，包括芦丁、槲皮素、绿原酸等［13］。因此，为较全面地对一枝黄花含漱液质量进行控制，本研究采用薄层色谱法（TLC）对其进行定性鉴别；同时建立高效液相色谱法（HPLC）对一枝黄花含漱液中绿原酸、芦丁、异槲皮苷与槲皮素4 个成分进行定量分析，以期为一枝黄花含漱液质量标准建立与院内制剂申报奠定基础。

1 实验材料

1.1 仪器 戴安U3000 高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；超声波仪（宁波新芝生物有限公司，型号：CLEAE01）；电子天平［奥豪斯仪器（常州）有限公司，型号：EX125ZH］；四孔加热水浴锅（上海力辰邦西仪器科技有限公司，型号：BHS-2）；低温冷却循环泵（上海亚荣生化仪器厂，型号：DLSB-6/20）；普通硅胶G 板（青岛裕宝精细化工有限公司）；暗箱式三用紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司，型号：ZF-7）；超纯水制造设备（四川卓越水处理设备有限公司）；调温电热套（北京永光明医疗器材有限公司，型号：DZTW）；电动薄层条带状点样器（上海科哲生化科技有限公司，型号：SP-Ⅲ）。

1.2 试药 一枝黄花购自毫州市泸谯药业有限公司（批号：1903290222），经福建省第二人民医院药学部倪立坚主任药师鉴定符合2020 年版《中华人民共和国药典》规定；对照品绿原酸（纯度96.1%，批号：110753-202018）、芦丁（纯度91.6%，批号：100080-202012）、异槲皮苷（纯度97.2%，批号：111809-201804）、槲皮素（纯度99.1%，批号：100081-201610）、一枝黄花对照药材（批号：121433-201304）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。一枝黄花含漱液样品及阴性制剂均为医院制剂中心自制。阿斯巴甜（批号：W17032015）购自江苏汉光甜味剂有限公司；安赛蜜（批号：2020055V）购自安徽维多食品配料有限公司；苯甲酸钠（批号：23051203）购自湖南新绿方药业有限公司。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 供试品溶液制备 取一枝黄花饮片30 g，加70%乙醇加热回流，300 mL/次，提取3次，每次1.5 h，放冷，滤过，合并滤液，放四孔水浴锅上加热至无醇味，加入阿斯巴甜0.01 g、安赛蜜0.1 g 和苯甲酸钠0.3 g，用纯化水定容至100 mL，即得一枝黄花含漱液原液。精密量取一枝黄花含漱液原液20 mL 置水浴锅加热蒸干，残渣加3 mL 甲醇溶解，过滤后取续滤液，作为供试品溶液，用于TCL 分析。取上述一枝黄花含漱液原液用0.22 µm 微孔滤膜滤过，取续滤液，用于HPLC 分析。

2.1.2 阴性供试品溶液制备 取阿斯巴甜0.01 g、安赛蜜0.1 g 和苯甲酸钠0.3 g，用纯化水溶解定容至100 mL，即得缺一枝黄花药材阴性原液，后按“2.1.1”项下同法分别制成用于TCL 与HPLC 分析的阴性供试品溶液。

2.1.3 对照药材溶液制备 取一枝黄花对照药材约2 g，加入石油醚（60～90 ℃）50 mL，超声处理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，滤过，弃去石油醚液，药渣挥干溶剂，加70%乙醇30 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL 甲醇溶解，作为对照药材溶液，用于TCL 分析。

2.1.4 混合对照品溶液制备 取芦丁对照品，加甲醇制成1 mg/mL 芦丁对照品溶液，用于TCL 分析。分别精密称取绿原酸、芦丁、异槲皮苷、槲皮素对照品适量，加甲醇分别制成1.080、1.248、0.832、0.720 mg/mL 单一对照品储备液。分别精密吸取各对照品储备液适量，加甲醇制成含上述4 个成分、浓度分别为216.00、624.00、41.60、36.00 µg/mL 的混合对照品溶液，摇匀，用于HPLC 分析。

2.2 TCL 法定性分析 参照《中华人民共和国药典》2020 年版四部通则（0502）进行TCL 分析，吸取供试品溶液10、15 µL，芦丁对照品溶液5 µL，对照药材溶液与阴性供试品溶液各15 µL，点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（8∶1∶1∶1）为展开剂展开，取出，晾干，置紫外光灯365 nm 下检视。结果表明：供试品色谱中，在与芦丁对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照无干扰，见图1。

图1 一枝黄花含漱液薄层色谱鉴别图

2.3 HPLC 法定量分析

2.3.1 色谱条件 SinoChrom ODS-BP C18色谱柱（4.6 mm ×250 mm，5 µm）；流动相：0.05%磷酸乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱：0～8 min，12%～20%A；8～15 min，20%～25%A；15～25 min，25%～35%A；25～40 min，35%～75%A；40～50 min，75%～12%A；50～60 min，12%～12%A；流速1 mL/min；检测波长360 nm；柱温25 ℃；进样量10 µL。见图2。

图2 一枝黄花含漱液HPLC 图

2.3.2 线性关系考察 取“2.1.4”项下的混合对照品溶液，稀释为一系列梯度浓度的混合对照品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进行测定，进样量为10 µL。以各化学成分进样量（µg）作为横坐标X，各成分峰面积作为纵坐标Y，绘制标准曲线并计算出各自的回归方程与相关系数。结果表明：4 个成分在一定进样量范围内与峰面积呈较好的线性关系，见表1。

表1 一枝黄花含漱液中4 个化学成分的线性回归方程

2.3.3 精密度试验 精密吸取“2.1.1”项下的供试品溶液10 µL，按“2.3.1”项下色谱条件进行测定，连续进样6 次，计算各组分峰面积RSD，结果显示：供试品溶液色谱中绿原酸、芦丁、异槲皮苷与槲皮素峰面积的RSD分别为1.57%、1.45%、1.50%、1.28%，表明该高效液相色谱仪精密度良好。

2.3.4 重复性试验 精密称取一枝黄花药材（批号：1903290222）6 份，按“2.1.1”项下方法制备成6 份一枝黄花含漱液。以“2.3.1”项下色谱条件分别进样，计算绿原酸、芦丁、异槲皮苷与槲皮素平均含量分别为63.22、159.5、10.35、10.50 µg/mL，各组分含量RSD 分别为1.54%、0.82%、1.27%、1.49%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 精密吸取按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，25 ℃室温放置，于0、2、4、6、12、24 h 分别按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，记录各组分峰面积，并计算绿原酸、芦丁、异槲皮苷与槲皮素峰面积RSD 分别为1.80%、0.59%、1.62%、1.16%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.3.6 加样回收率试验 精密称取一枝黄花药材（批号：1903290222）6 份，按“2.1.1”项下方法平行制备6 份一枝黄花含漱液，每份取2 mL，分别加入适量“2.1.4”项下各单一对照品溶液，按“2.3.1”项下色谱方法进样分析，计算加样回收率。结果显示：绿原酸、芦丁、异槲皮苷与槲皮素的加样回收率分别为99.12%、99.97%、98.46%、98.97%，各组分RSD分别为1.82%、1.27%、2.02%、2.28%。表明该方法准确性高，见表2。

表2 加样回收率试验结果

2.3.7 样品含量测定 按“2.1.1”项下方法分别制成3 批次供试品溶液，并按“2.3.1”项下色谱条件分别进样，记录各组分峰面积，代入“2.3.2”项下方程计算一枝黄花含漱液中各待测组分含量，见表3。

表3 3 批次样品含量测定表（n=3） µg/mL

3 讨 论

3.1 薄层鉴别 在薄层色谱鉴别中对比了水提醇沉与乙醇加热回流2 种提取方法，发现采用水提醇沉法所制备样品在薄层色谱上斑点拖尾严重，分离度不理想，而乙醇回流提取方法能明显改善上述现象。进一步对乙醇浓度进行考察，分别采用30%、50%、70%和纯乙醇回流提取，发现70%乙醇提取的样品在色谱上斑点分离度较好，与对照品以及对照药材色谱相应位置上，观察到相同颜色的斑点且显色清晰，阴性无干扰。因此本试验最终采用70%乙醇加热回流提取样品。

3.2 HPLC 法流动相选择 参考文献［14-15］，本次试验共设计考察了0.1%甲酸甲醇-0.2%甲酸水、0.1%甲酸乙腈-0.2%甲酸水、0.05%磷酸乙腈-0.1%磷酸水溶液3 种不同的流动相体系。结果发现：0.1%甲酸甲醇-0.2%甲酸水色谱基线出现下漂现象且色谱峰表征数量较少；0.1%甲酸乙腈-0.2%甲酸水出现部分色谱峰的分离度较低；采用0.05%磷酸乙腈-0.1%磷酸水发现色谱峰分离度与峰形较好且基线平稳。

3.3 检测波长选择 参照文献［16-17］，结合对比了5 种不同波长下一枝黄花含漱液色谱峰的表征效果，以一枝黄花药典指标成分芦丁峰面积大小为参照依据，发现在360 nm 波长下，4 个待测成分的色谱峰峰形对称，分离度良好，因此最终确定以360 nm 波长作为本次HPLC 定量方法的检测波长。

综上，本实验所建立的一枝黄花含漱液TLC 法鉴别的专属性强，斑点清晰且阴性对照无干扰；建立HPLC 法同时测定一枝黄花含漱液中绿原酸、芦丁、异槲皮苷与槲皮素4 个成分的含量，经精密度、稳定性、重复性与加样回收率方法学考察验证，该方法稳定性好，操作简便，可为一枝黄花含漱液质量控制提供实验依据。