督脉灸对肾阳虚大鼠肝细胞线粒体结构及ATP含量的影响

罗彩云，王志福，戴荣水，兰艳艳，庞莉娜

（1.福建中医药大学附属第三人民医院，福建 福州 350108；2.福建中医药大学附属康复医院，福建 福州 350003；3.福建中医药大学康复医学院，福建 福州 350122）

肾阳虚是临床常见证型之一，普遍存在各个系统疾病中，改善肾阳虚证候对疾病发生、发展、预后及转归起着至关重要的作用。肾阳虚的发生、发展与线粒体密切相关［1］，有学者研究发现肾阳虚模型动物肝细胞线粒体结构不完整，甚至线粒体消失［2］。可见，肝细胞线粒体结构受损可能是肾阳虚发生的主要病理机制。前期研究发现督脉灸可明显改善肾阳虚畏寒、怕冷等症状，但其作用机制尚不明确。故本研究从肝细胞线粒体结构和功能修复的角度，初步探讨督脉灸治疗肾阳虚的作用机制，为其在临床应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF 级8 周龄雄性SD 大鼠24 只，体质量（280±20）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物生成许可证号：SCXK（京）2019-0008，饲养于福建中医药大学动物实验室中心SPF 级动物实验室，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2020-0002。大鼠每日光照12 h 明暗交替，在室温（22±1）℃、湿度50%～70%环境中，自由饮水进食。本实验经福建中医药大学动物伦理委员会审批（FJTCM-IACUC 2022025）。

1.2 实验药物 艾绒购自南阳市卧龙汉医艾绒厂。

1.3 实验试剂 氢化可的松注射液（山西省芮城县兽药有限责任公司，货号：56688）；电镜固定液、ATP 含量检测试剂盒均购自武汉赛维尔生物科技有限公司（货号：G1102、BC0305）；无水乙醇、丙酮均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.4 实验仪器 KZ-Ⅱ高速组织研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司）；D3024R 台式高速冷冻离心机（上海启前电子科技有限公司）；MX-F 涡旋混合器（武汉赛维尔生物科技有限公司）；JB-P5 包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；UC7 超薄切片机（德国Leica 公司）；HT7700 透射电镜（日本Hitachi 公司）；Epoch 酶标检测仪（美国Bio-Tek 公司）；Ultra 45°钻石切片刀（瑞士Daitome 公司）；LC-2030 高效液相色谱仪［日本岛津企业管理（中国）有限公司］；YHM-2kg 0.01 英衡电子秤（惠州市英衡电子科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 分组和造模 采用随机数字表法将24 只SD大鼠分为空白组、模型组和督灸组，每组8 只。空白组不予造模；模型组和督灸组按25 mg/kg 皮下注射氢化可的松注射液，每日1 次，连续注射7 d，当大鼠体质量和肛温均明显降低，并表现出畏寒肢冷、卷缩扎堆等状态时，提示肾阳虚大鼠造模成功［3］，见表1。

表1 3 组造模前后体质量、肛温比较（±s）

表1 3 组造模前后体质量、肛温比较（±s）

注：与造模前比较，1） P＜0.05；与空白组比较，2） P＜0.05。

组别空白组模型组督灸组肛温/℃35.19±0.36 35.21±0.35 35.01±0.24 34.38±0.301）2）35.04±0.45 34.48±0.311）2）n888时间造模前造模后造模前造模后造模前造模后体质量/g 295.75±3.77 337.88±4.991）300.00±9.61 277.57±15.931）2）298.75±9.32 277.75±11.211）2）

2.2 实验干预 将督灸组大鼠固定于鼠板上，充分暴露背部，剔除背部施灸部位的毛发。以督脉为中心，将长8 cm、宽4 cm 的纯棉薄布平铺于督脉上，将打碎好的姜泥做成底宽1 cm、顶宽0.5 cm、高0.5 cm 的梯状，平铺在纯棉薄布上；将厚约1 cm 艾绒铺于姜泥之上，点燃艾绒，至其完全燃尽。在皮肤与棉布之间放置2 个温度控制器，控制灸温在38 ℃，若高于38 ℃则再垫一层棉布。隔日1 次，连续督脉灸4 次。空白组和模型组大鼠同督灸组固定在鼠板上，但不予督脉灸干预。

2.3 取材 3 组大鼠取材前一晚禁食过夜，次日早上按1 mL/100 g 腹腔注射20%乌拉坦麻醉大鼠后［4］，剖开大鼠腹腔，快速取下肝脏，用预冷PBS 缓冲液清洗，过滤纸吸净残留在肝组织表面的PBS 缓冲液，用剪刀将肝组织分成2 份，一部分置于4 ℃、2.5%戊二醛电镜固定液中，用于透射电镜观察。另一部分肝组织放置于冰浴上剪碎成泥状，按体质量（g）∶提取液体积（mL）=1∶9 的比例称取0.1 g肝脏组织，加入0.9 mL 生理盐水进行冰浴匀浆，制备成10%匀浆液，在4 ℃、8 000 r/min下离心10 min，提取上清液至另一EP 管中，加入500 µL 氯仿充分震荡混匀，置冰上备用，用于肝细胞线粒体ATP 含量测定。

2.4 观察指标

2.4.1 体质量及肛温测定 应用电子秤、体温计测定3 组干预前后体质量、肛温，并记录。

2.4.2 肝细胞线粒体结构观察 取出2.5%戊二醛电镜固定液中备用的肝组织，常规石蜡包埋、修块、定位、超薄切片后用透射电镜观察组织切片，先在低倍视野（×1 000～5 000）下确定观察区域，然后在高倍视野（×10 000～50 000）下观察肝细胞线粒体的分布、形态变化。

2.4.3 肝细胞线粒体ATP 含量检测 取出置冰上备用的上清液，在10 000 r/min、4 ℃下离心3 min，取上清，将上清液加样于酶标板孔中，余操作严格按照大鼠ATP 含量检测试剂盒说明书测定步骤进行。

2.5 统计学方法 采用SPSS 24.0 软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，组内比较采用配对样本t检验；组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐性采用LSD-t检验，方差不齐采用Games-Howell 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结 果

3.1 3 组体质量、肛温比较 见表2。

表2 3 组体质量、肛温比较（±s）

表2 3 组体质量、肛温比较（±s）

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

肛温/℃35.24±0.64 34.70±0.36 36.28±0.392）组别空白组模型组督灸组n888体质量/g 365.62±8.12 311.42±16.671）315.13±12.48

3.2 3 组大鼠肝细胞线粒体结构变化 空白组大鼠肝细胞线粒体数量丰富，大部分线粒体膜完整，嵴存在，膜内基质均匀。模型组大鼠肝细胞线粒体数量明显减少，分布不均匀，部分线粒体核膜模糊，嵴减少，出现严重的膜破损、崩解。督灸组大鼠肝细胞线粒体数量较多，形态较完整，基质浅，嵴少量断裂、变短，个别损伤严重者可见灶性改变。见图1。

图1 3 组大鼠肝组织电镜图（×50 000）

3.3 3 组肝细胞线粒体ATP 含量比较 见表3。

表3 3 组肝细胞线粒体ATP 含量比较（±s） µmol/g

表3 3 组肝细胞线粒体ATP 含量比较（±s） µmol/g

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

ATP 4.12±0.15 3.24±0.661）4.09±0.202）组别空白组模型组督灸组n888

4 讨 论

肾阳是温煦、推动、调节人体各种生命活动的原动力，为诸阳之本。肾阳亏虚，一切生命活动动力不足，温煦、推动、调节功能下降，脏腑功能衰退，导致各种严重疾病发生。线粒体是机体能量代谢的主要场所，碳水化合物、脂肪、蛋白质三大营养素最终均在线粒体中被氧化磷酸化并释放能量（ATP），细胞活动所需95%能量均来自线粒体，故线粒体又被认为是机体生命活动动力工厂［5］。线粒体在细胞增殖、代谢和凋亡等过程中起着至关重要的作用［6］，在功能上调控能量的产生、电子传递链、细胞信号、凋亡和程序性细胞死亡，线粒体的功能紊乱会导致严重的健康问题［5］。可见，中医的“肾阳”对机体的温煦、推动、调控作用与现代生物学“线粒体能量代谢”对生命活动的推动、调控作用有着共通之处，中医“肾阳”与现代医学能量物质“ATP”有着共性的含义［7］。

线粒体由双层膜构成，其内膜结构在能量转换功能中起着主要作用。线粒体内膜内为基质，内膜高度摺叠形成许多嵴伸入基质，增加了内膜表面积。线粒体内膜上分布有电子传递复合物和线粒体代谢相关酶蛋白分子，故线粒体结构与ATP 合成密切相关。若线粒体嵴膜破坏、线粒体肿胀将引起线粒体电子传递受阻，氧化磷酸化解偶联，产能下降，导致ATP 合成减少［8］。肝脏中存在着大量线粒体，是机体调节能量和存储能量的重要器官。研究表明，肾阳虚模型大鼠肝脏细胞线粒体肿胀，内膜边缘模糊不完整，嵴排列紊乱，出现云絮样变，甚至断裂消失，电子密度变低，基质颜色较淡，部分线粒体空泡样变性、消失；肝脏组织Na+-K+-ATP 酶和Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性显著降低，导致线粒体氧化磷酸化的产能过程障碍，ATP 含量减少，体质量、体温显著降低［2，7，9-10］。综上所述，肾阳虚发生与肝细胞线粒体结构受损，ATP 合成障碍存在密切相关性。

本研究结果显示：① 肾阳虚大鼠肝细胞线粒体数量明显减少，分布不均匀，部分线粒体核膜模糊，嵴减少，甚至出现膜破损、崩解，结构损伤严重，提示肝细胞线粒体结构破坏可能是肾阳虚的重要病理基础。② 督脉灸可有效促进肾阳虚大鼠肛温回升，可明显改善肾阳虚畏寒、怕冷的症状。③ 督脉灸干预可使肾阳虚大鼠肝细胞线粒体数量增多，分布均匀，形态结构得以修复，ATP 含量增加，提示督脉灸可能通过修复肝细胞线粒体结构，增加ATP含量，进而提高机体线粒体能量代谢，从而改善肾阳虚证候。